Môi trường NBTN là môi trường phức tạp, chứa hơn 50 nguyên tố, một lượng lớn và đa dạng các hợp chất hữu cơ. Đối với nuôi cấy tảo thì sử dụng trực tiếp NBTN là rất hiếm. NBTN không được bổ sung các chất dinh dưỡng và các nguyên tố vi lượng nên sự tăng trưởng của tảo rất chậm. Bên cạnh đó, thành phần nước biển không ổn định trong suốt cả năm, khó kiểm soát được hàm lượng dinh dưỡng, các yếu tố vi lượng và có thể khác nhau ở các vị trí và thời gian thu mẫu, vì thế dẫn đến hạn chế khả năng tăng trưởng của vi tảo và độ chính xác của các thí nghiệm. Ngoài ra, quá trình thu và vận chuyển NBTN gặp nhiều khó khăn ở những nơi sâu trong nội địa. Do đó, việc lựa chọn NBNT là điều cần thiết để nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm (Harrison and Berges, 2005).
Lợi ích của các môi trường NBNT là có thể kiểm soát chính xác nồng độ dinh dưỡng, tỷ lệ chất dinh dưỡng và có cơ hội để lặp lại các thí nghiệm giống điều kiện ban đầu (Harrison and Berges, 2005; Moreaux et al., 2007).
Môi trường NBNT chứa các ion quan trọng và các tác nhân tạo chelat để duy trì đầy đủ hàm lượng các nguyên tố vi lượng trong dung dịch và các nhân tố tăng trưởng hữu cơ. Theo Droop (1961, 1962), sự hình thành chelat của các nguyên tố vi lượng, đệm pH và sự cân bằng thế oxi hóa khử, một số hay tất cả các đặc tính hóa lý này của một môi trường có thể quyết định đến sự tăng trưởng của loài thực vật phù du hơn là tỷ lệ của các ion chính (Fogg and Thake, 1987).
Ở môi trường NBTN, chuỗi tế bào dài khoảng 2 – 3 tb/chuỗi từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 6, thể sắc tố nhạt màu từ ngày thứ 3 (ảnh 3.17), đường cong tăng trưởng có dạng đường thẳng (hình 3.3), sinh khối tối đa của quần thể thấp hơn so với các môi trường còn lại (bảng 3.5). NBTN không tốt cho sự tăng trưởng liên tục của tảo trong phòng thí nghiệm, nguyên nhân chính là do một số chất dinh dưỡng cần thiết thường chỉ hiện diện một lượng nhỏ (Fogg and Thake, 1987) và một số muối bị kết tủa khi hấp khử trùng (Ahmad and Khan, 2010) nên làm cho nhiều vi tảo cũng như
Chaetoceros subtilis var. abnormis tăng trưởng và phát triển kém.
Môi trường f/2 cho hình thái tế bào và sự tăng trưởng tốt, mật độ tế bào cao (ảnh 3.16; bảng 3.5). Ở các môi trường NBNT khảo sát, môi trường ESAW cho hình thái tế bào và sự tăng trưởng của tảo tốt hơn, ổn định hơn so với môi trường NBNT còn lại (ảnh 3.19; bảng 3.5). Mật độ tế bào trên môi trường ESAW thấp hơn môi trường f/2 nhưng lại cho hình thái tế bào và pha tăng trưởng dài hơn (hình 3.3), ngoài ra môi trường f/2 được pha chế từ NBTN nên sẽ không chủđộng trong các thí nghiệm như môi trường ESAW. Nên môi trường ESAW được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.4. Ảnh hưởng của N lên sự tăng trưởng của Chaetoceros subtilis var.
abnormis Proschkina-Lavrenko
3.2.4.1. Ảnh hưởng của N – NO3- lên sự tăng trưởng của Chaetoceros subtilis
var. abnormis Proschkina-Lavrenko
Đối với Chaetoceros subtilis var. abnormis trên các môi trường bổ sung N – NO3- từ 250 µmol/L đến 1000 µmol/L đều có sự tăng trưởng tốt với chuỗi tế bào dài và thể sắc tốđậm màu từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 6, mật độ tế bào, cường độ quang hợp và hô hấp cao (ảnh 3.24, 3.25, 3.26, 3.27; bảng 3.7, 3.9, 3.10).
Nitrate không chỉ là chất dinh dưỡng mà còn là tín hiệu ở thực vật. NO3- cảm ứng sự biểu hiện gene của các enzyme cho quá trình biến dưỡng của chính nó. Các enzyme được cảm ứng bởi NO3- là nitrate reductases, nitrite reductases, các chất vận chuyển nitrate, glutamine synthetase, glutamate synthetase, ferrodoxin và
ferredoxin NADP+ reductase (Foyer and Noctor, 2002). Hoạt tính của enzyme nitrate reductase ở của cây Dưa chuột cao khi bổ sung NO3- và bằng 0 khi bổ sung NH4+ (Roosta et al., 2009). Theo Duncan and Stewart (1974), hoạt tính cao của nitrate reductase ở tảo khi nuôi cấy trên môi trường bổ sung NO3- và thấp khi tảo được nuôi cấy trên môi trường bổ sung NH4+ hoặc hoạt tính tăng ở Chlorella khi chuyển từ môi trường chứa NH4+ sang môi trường không có N và cao hơn khi chuyển sang môi trường có bổ sung NO3-.
Nitrate reductase ở thực vật được điều hòa ở mức phiên mã cũng nhưở mức sau phiên mã bởi những tín hiệu ngoại sinh (như ánh sáng) hay nội sinh, hoạt tính của enzyme này ở lá cây Dưa chuột tăng khi bổ sung NO3- lên đến RAR (relative addition rate) 0,35/ngày và không thay đổi khi bổ sung NO3- cao hơn. Hơn thế, NO3- có khả năng tích lũy với hàm lượng cao trong các mô của thực vật mà không gây độc khi nồng độ NO3- trong môi trường cao (Roosta et al., 2009). Do đó,
Chaetoceros subtilis var. abnormis có thể sử dụng NO3-ở phổ rộng với các nồng độ 250 µmol/L, 500 µmol/L, 750 µmol/L, 1000 µmol/L.
Trong khi đó, ở môi trường đối chứng và bổ sung 75 µmol/L N-NO3-, sự tăng trưởng của tảo bị hạn chế và thấp hơn so với các môi trường còn lại, với sự hình thành bào tử nghỉ và thể sắc tố nhạt màu (ảnh 3.22, 3.23), mật độ tế bào, cường độ quang hợp thấp (bảng 3.7, 3.9). Nguyên nhân do sự giới hạn của N trong môi trường đã hạn chế sự tăng trưởng cũng như làm giảm hàm lượng diệp lục tố a trong tế bào.
Trong điều kiện thiếu hụt N kéo dài, PSII bị ảnh hưởng mạnh do sự mất các protein của trung tâm phản ứng, trong khi không có ảnh hưởng lên PSI. Có sự suy thoái chọn lọc của các phycobilisome gắn với PSII ở vi khuẩn lam, tuy nhiên không thấy có sự thay đổi ở các protein liên kết với PSI trong các tế bào Chlamydomonas
sp. bị giới hạn N. Nguyên nhân của sựảnh hưởng mạnh và chọn lọc của sự thiếu hụt N lên PSII có thể liên quan đến sự đổi mới nhanh của D1 và D2 (Berges et al., 1996).
D1 và D2 liên kết với nhiều thành phần quan trọng của PSII gồm P680, Phyophytin, QA, QB, Tyr Z, Tyr D. Ngoài ra còn có 4 phân tử chlorophyll và 1-2 phân tử β- carotene. D1 và D2 cũng liên kết với Mn, Ca, Cl và phức hợp thải oxi cùng Cytochrom b-559 và 1 số thành phần khác nữa (Đặng Đình Kim và Đặng Hoàng Phước Hiền, 1999). Do đó, ảnh hưởng đến D1 và D2 sẽ ảnh hưởng lên hoạt động quang hợp của PSII. Vì vậy, trong môi trường đối chứng hoặc bổ sung NO3-
nồng độ thấp (75 µmol/L) thì cường độ quang hợp thấp (hình 3, 4).
3.2.4.2. Ảnh hưởng của N – NH4+ lên sự tăng trưởng của Chaetoceros subtilis
var. abnormis Proschkina-Lavrenko
Môi trường bổ sung N – NH4+ ở các nồng độ 250 µmol/L, 500 µmol/L, 750 µmol/L và 1000 µmol/L, sự tăng trưởng của tảo giảm và không có sự khác biệt so với đối chứng, với chuỗi tế bào ngắn, thể sắc tố nhạt màu (ảnh 3.22, 3.29, 3.30, 3.31, 3.32), mật độ tế bào, cường độ quang hợp và hô hấp thấp (bảng 3.11, 3.13, 3.14). Đặc biệt, ở ba môi trường bổ sung 500 µmol/L, 750 µmol/L và 1000 µmol/L N – NH4+, sự tăng trưởng của tảo giảm mạnh với sự hình thành bào tử từ ngày thứ 2, thứ 3 (ảnh 3.30, 3.31, 3.32). Mật độ tế bào, cường độ quang hợp và hô hấp gần như bằng 0 từ ngày thứ 5 đối với hai môi trường bổ sung 750 µmol/L và 1000 µmol/L N – NH4+ (bảng 3.11, 3.13, 3.14).
Theo Bùi Trang Việt (2000) và Kotsiras et al. (2002), NH4+ đối kháng với K+, Ca2+ hay Mg2+. Do đó, sử dụng NH4+ quá liều sẽ gây thiếu K+, Ca2+ hay Mg2+. NH4+ cản trở NO3-, nhưng giúp các ion phosphor vào tế bào. Sự thừa NH4+ thường rất độc so với NO3-, vì gây nhiều xáo trộn trong tính thấm của tế bào.
Sự bổ sung NH4+ở nồng độ cao gây ra sự giảm hàm lượng Ca2+, K+ và Mg2+, tuy nhiên NO3- có ảnh hưởng ngược lại. NH4+ cạnh tranh tích cực với K+ và ức chế sự hấp thu K+, làm tăng pH của tế bào. Sự thiếu hụt Ca2+ trong quá trình dinh dưỡng NH4+ có thể gây mất tính toàn vẹn của màng, do đó làm giảm nồng độ của K+ và Mg2+ và ảnh hưởng đến chức năng của lục lạp và ty thể. Ngoài ra, tốc độ sinh tổng
hợp acid hữu cơ cao có thể làm bất động Ca2+ và Mg2+ trong rễ ở cây Dưa chuột (Kotsiras et al., 2002).
Theo Becker (1994), sựđồng hóa NO3- và NH4+ có liên quan chặt chẽ với pH của môi trường, sự hấp thu N làm thay đổi pH. Khi NH4+được sử dụng như một nguồn N duy nhất, pH của môi trường có thể giảm nhanh đến mức thấp pH = 3 do sự giải phóng H+ ra môi trường, gây ra những tác dụng phụ có hại cho tế bào. Một số tảo nhạy cảm với nồng độ NH4+ cao và sự tăng trưởng của chúng bị ức chế ở nồng độ NH4+ khoảng 1 mM. Sự thay đổi pH này có thể là nguyên nhân ức chế sự tăng trưởng được quan sát ở một số tảo gây ra do nồng độ NH4+ cao trong môi trường như sự tăng pH nội bào do sự thâm nhập của các phân tử NH3. Ở nồng độ NH4+ cao, NH3 khuếch tán một cách tự do qua pha lipid của màng (Caneja and Brezo, 2007). Vì thế, với môi trường ESAW bổ sung N – NH4+ nồng độ cao (250 µmol/L, 500 µmol/L, 750 µmol/L và 1000 µmol/L) đã gây độc cho tảo dẫn đến sự tăng trưởng giảm trong quá trình khảo sát.
Với điều kiện loại bỏ hoàn toàn N trong môi trường đối chứng, tảo có chuỗi tế bào ngắn, thể sắc tố nhạt màu, có sự hình thành bào tử nghỉ từ ngày thứ 2 (ảnh 3.22), mật độ tế bào, cường độ quang hợp và hô hấp ở mức thấp nhưng ổn định hơn so với các môi trường bổ sung N – NH4+ nồng độ cao (750 µmol/L và 1000 µmol/L) trong quá trình khảo sát (bảng 3.11, 3.13, 3.14). Smith et al. (1992) và Parkhill et al. (2001) đã nhận thấy, ảnh hưởng của sự thiếu hụt N lên tảo silic nước mặn thì chậm hơn so với các nuôi cấy dư thừa N khi so sánh giữa các điều kiện nuôi cấy giới hạn N. Sự thiếu hụt N và P trong môi trường cũng dẫn đến sự hình thành bào tử nghỉ (Kuwata et al., 1993) và ảnh hưởng mạnh lên PSII (Berges et al., 1996).
Trong khi đó, ở môi trường bổ sung N – NH4+ với nồng độ thấp 75 µmol/L, sự tăng trưởng của tảo tốt hơn, với thể sắc tốđậm màu và chiếm toàn bộ thể tích tế bào từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 6 (ảnh 3.28), mật độ tế bào, cường độ quang hợp và hô hấp cao hơn và khác biệt hoàn toàn so với các môi trường còn lại (bảng 3.11, 3.13, 3.14; hình 3.7, 3.8, 3.9. Tuy nhiên, sự tăng trưởng của tảo trên các môi trường bổ
sung N – NH4+ thấp hơn nhiều so với sự tăng trưởng của tảo trên các môi trường bổ sung N-NO3-. Điều này có thểđược giải thích là do tính độc của NH4+ so với NO3-.
Theo Hachiya and Noguchim (2011), khả năng sử dụng N là yếu tố quyết định lên sự tăng trưởng, cường độ quang hợp và hô hấp của thực vật. Khi NH4+ là nguồn N duy nhất ở nồng độ mM sẽức chế sự tăng trưởng của thực vật so với dạng N – NO3-
(gọi là tính độc của NH4+). Khi NH4+ là dạng N chiếm ưu thế, sự cân bằng giữa NH3 và NH4+ có thể làm phá vỡ gradient proton qua màng thylakoid, màng trong ty thể hay màng không bào.
Tính độc của NH4+ được cho là do sự tích lũy của nó trong các mô quang hợp. Việc tách rời sự vận chuyển điện tử khỏi sự quang phosphorin hóa được cho là do tính độc của NH4+. Giả thuyết này được Krause et al. (1982) quan sát thấy, NH4+
tách sự vận chuyển điện tử ở các màng thylakoid được cô lập. Hàm lượng diệp lục tố a, diệp lục tố b và carotenoid trên đơn vị sinh khối khô tương đối thấp ở các cây Dưa chuột bổ sung NH4+ so với bổ sung NO3- (Roosta et al., 2009).
3.2.4.3. Ảnh hưởng kết hợp giữa N – NO3- và N – NH4+ lên sự tăng trưởng của
Chaetoceros subtilis var. abnormis Proschkina-Lavrenko
Dựa trên các kết quả cho thấy, ở môi trường bổ sung N- NH4+ nồng độ cao (750 µmol/L) đã gây độc cho tế bào, với sự tăng trưởng của tảo giảm, thể sắc tố nhạt màu, sự hình thành bào tử từ ngày thứ 4, cường độ quang hợp và hô hấp thấp (ảnh 3.33; bảng 3.17, 3.18).
Trong khi đó, trên các môi trường bổ sung N- NO3- và N- NH4+ở các tỷ lệ khác nhau, sự tăng trưởng của tảo tốt hơn với chuỗi tế bào dài hơn, thể sắc tốđậm màu từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 5 (ảnh 3.35, 3.36, 3.37), mật độ tế bào (bảng 3.15; hình 3.10), cường độ quang hợp và hô hấp cao hơn (bảng 3.17, 3.18; hình 3.11, 3.12). Điều này có thể là do ảnh hưởng của N- NO3- làm giảm tính độc của N- NH4+ trong môi trường. Theo Roosta et al. (2009), việc bổ sung NO3- (cũng như K+) vào môi trường chứa NH4+ là một giải pháp để làm giảm tính độc của NH4+.
Đặc biệt, ở môi trường bổ sung N- NO3- và N- NH4+ tỷ lệ 2:1 có chuỗi tế bào dài, mật độ tế bào và cường độ quang hợp cao hơn các môi trường còn lại (ảnh 3.36; bảng 3.15, 3.17). Điều này có thể là do tác dụng kích thích của N- NH4+ở nồng độ thấp làm tăng khả năng hấp thu và tích lũy của N- NO3- vào tế bào. Theo Roosta et al. (2009), hàm lượng NO3- trong tất cả các mô của trái Dưa chuột cao nhất khi NO3- chiếm 100% và 75% N tổng số trong môi trường, ngược lại, hàm lượng NO3-
thấp nhất xảy ra khi NH4+ chiếm 75% N tổng số ở tất cả các nồng độ. Trong môi trường sự hiện diện với lượng NH4+ nhỏ có thể kích thích sự hấp thu của NO3- (Dortch, 1990; Varela and Harrison, 1999).
Ở các môi trường bổ sung N- NO3- và N- NH4+ tỷ lệ 1:1 và 1:2 có mật độ tế bào, cường độ quang hợp và hô hấp thấp hơn so với môi trường bổ sung 750 µmol/L N- NO3-, và bổ sung N- NO3- và N- NH4+ tỷ lệ 2:1 (bảng 3.15, 3.17, 3.18; hình 3.10). Điều này có thể là kết quả tương tác ức chế của NH4+ đối với NO3- khi có sự hiện diện đồng thời chúng trong môi trường.
Đối với hầu hết tảo thì NH4+ được ưu tiên sử dụng trước khi cung cấp đồng thời N- NH4+ và N- NO3-. N-NO3- không được sử dụng cho đến khi tất cả N- NH4+được sử dụng hết. Sử dụng ưu tiên N- NH4+ được cho là có liên quan đến sự điều hòa đồng hóa NO3-. Việc bổ sung NH4+ vào môi trường nuôi cấy tảo đang đồng hóa NO3- gây ra sựức chế ngay lập tức và hoàn toàn sựđồng hóa NO3-, NH4+ không ức chế hoạt tính của enzyme nitrate reductase mà là một số sản phẩm của sự đồng hóa NH4+ức chế ngược hoạt tính của nitrate reductase (Duncan and Stewart, 1974).
NH4+ ảnh hưởng lên sự biến dưỡng NO3- ở tảo nước mặn. NH4+ được cho là nguồn N ưa thích đối với hầu hết các loài thực vật phù du cũng nhưức chế sử dụng NO3- (Dortch, 1990; Varela and Harrison, 1999). Một sản phẩm N hữu cơđầu tiên (glutamine - GLN) của quá trình đồng hóa N vô cơđóng vai trò trung tâm trong sự điều hòa ngắn hạn và dài hạn quá trình đồng hóa NO3- (Flynn et al., 1997).
Ở thực vật phù du, tốc độ hấp thu NO3- bị ức chế khi có sự hiện diện của NH4+ (Dortch, 1990). Tốc độ hấp thu NO3- giảm khi nồng độ của NH4+ tăng lên trong môi
trường (Varela and Harrison, 1999). Điều này là do sự ức chế hấp thu NO3- của NH4+ hoặc sựưu tiên của NH4+. Mặc dầu có sựưu tiên đối với hấp thu NH4+ nhưng sự tăng trưởng trên NO3- tốt hơn nhiều so với tăng trưởng trên NH4+ (Dortch, 1990). Flynn et al. (1997) đã xây dựng mô hình toán học dựa trên kết quả thực nghiệm để mô phỏng các đặc điểm chính của sự tương tác giữa quá trình vận chuyển và đồng hóa NH4+ và NO3-ở thực vật phù du (hình 3.21). Mô hình sử dụng kích cỡ của một nhóm nội bào đó là sản phẩm hữu cơ đầu tiên của quá trình đồng hóa N (glutamine) để điều hòa sựđáp ứng nhanh chóng trong tương tác NH4+ - NO3-. Sự