Hiệu điện thế (V) Thời gian (t) V.t (V - giờ) Chế độ tăng V
7cm 17cm 7cm 17cm 7cm 17cm
Bước 1 50 12 giờ 0 Trương gel
Bước 2 125 2 giờ ... ... Tuyến tính
Bước 3 250 15 phút ... ... Nhanh
Bước 4 4.000 10.000 1 giờ 2 giờ ... ... Chậm
Bước 5 4.000 10.000 ... ... 10.000 40.000 Nhanh
Tổng ~ 18 giờ ~ 20 giờ ~ 14.000 ~ 60.000
Trong nghiên cứu này, mỗi cặp mẫu bệnh và đối chứng của từng bệnh nhân được tiến hành điện di hai chiều thành hai cặp bản gel. Sau khi kết thúc điện di hai chiều, một cặp bản gel được cố định protein bằng dung dịch chứa axit phosphoric 1,3%, methanol 20% trong một giờ, sau đó, nhuộm qua đêm bằng Coomassie G250 theo phương pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff (1988). Phương pháp nhuộm này đạt độ nhạy cao, có thể hiện lên các spot chỉ chứa 30ng protein [37]. Hình ảnh các protein trên bản gel này được chụp lại, lưu giữ, phân tích đánh giá mức độ biểu hiện và so sánh với cơ sở dữ liệu sẵn có hoặc cắt, thủy phân spot protein để phân tích khối phổ. Cặp bản gel cịn lại sẽ được dùng để điện chuyển sang màng PVDF để thực hiện phản ứng miễn dịch Western Blot.
2.2.4. Western Blot
Western Blot hay còn gọi là kỹ thuật thẩm tách miễn dịch, đây là kỹ thuật đang được sử dụng rộng rãi để phát hiện sự có mặt của các protein cụ thể trong mẫu nghiên cứu dựa vào tương tác đặc hiệu của kháng nguyên - kháng thể. Tiến hành kỹ thuật Western Blot sử dụng kit ECL AdvanceTM Western blotting detetion (GE
Healthcare, Mỹ) để xác định kháng nguyên cố định là protein trong dịch chiết mô gan sử dụng kháng thể bậc một là huyết tương của người bệnh và kháng kháng thể
Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
(kháng thể bậc hai) liên kết với peroxidase cỏ ngựa (HRP), enzyme này xúc tác cho phản ứng oxy hóa Luminol gây ra hiện tượng phát quang. Sự phát sáng tối đa xuất hiện ở bước sóng 425nm. Q trình thực hiện gồm các bước sau:
Tiến hành điện đi biến tính để phân tách protein trong mô gan trên bản gel polyacrylamide 10% có SDS.
- Điện chuyển qua đêm ở 4oC để chuyển protein trong gel lên bề mặt màng PVDF.
- Nhuộm màng bằng dung dịch Ponceau S để kiểm tra hiệu quả chuyển màng, sau đó, tẩy trắng màng bằng H2O và ủ màng với dung dịch blocking trong 1 giờ. - Ủ màng qua đêm với dung dịch kháng thể bậc 1 (huyết tương của người bệnh) đã pha lỗng. Sau đó, rửa sạch màng để loại bỏ kháng thể thừa và các liên kết không đặc hiệu.
- Ủ màng với dung dịch kháng thể bậc hai (kháng kháng thể gắn với HRP) được pha loãng theo tỷ lệ 1:10.000 trong 1 giờ. Rửa bỏ kháng thể thừa.
- Ủ màng với dung dịch chứa Luminol và H2O2, để trong bóng tối 5 phút, ghi lại hình ảnh phát quang trên màng PVDF.
2.2.5. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, kết quả Western Blot
Hình ảnh các bản gel điện di hai chiều và hình ảnh phát quang trên màng PVDF sau khi thực hiện phản ứng kháng nguyên - kháng thể được số hóa bằng cách qt vào máy tính có phần mềm chuyên dụng Phoretix (Shimazdu, Nhật Bản) để
phân tích hình ảnh. Trước tiên, phần mềm sẽ xác định tất cả các spot protein có trên mỗi bản gel và màng, mỗi spot đều được xác định số thứ tự, vị trí, thể tích (tính theo độ lớn và độ đậm nhạt của spot) trên bản gel/màng. Phần mềm này còn cho phép xác định các spot protein tương ứng trên từng cặp bản gel. Dựa vào cường độ khối trung bình của từng spot (nomalized volume - được tính bằng thể tích của spot đó chia cho tổng thể tích các spot trên tồn bản gel nhân với 100) có thể chỉ ra điểm khác biệt giữa bản gel/màng mẫu bệnh so với bản gel/màng mẫu đối chứng (hình 4).
Luận văn cao hc Lê Lan Ph-ơng
Sau khi phõn tớch hỡnh ảnh, chúng tơi có thể chỉ ra các spot protein xuất hiện trên bản gel/màng này mà không xuất hiện trên bản gel/màng khác; các spot protein biểu hiện tăng, giảm ở các bản gel/màng khác nhau. Dựa vào kết quả này, chúng tôi xác định các spot protein ở các mẫu nghiên cứu có thể cắt ra khỏi bản gel phục vụ cho các phân tích tiếp theo. Đồng thời cũng xác định được các điểm protein tương ứng trên màng có tính kháng ngun, đây chính là các protein kích thích sinh ra đáp ứng miễn dịch chống ung thư.
Hình 4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm Phoretix 2.2.6. Cắt và thủy phân spot trên bản gel điện di hai chiều
Các spot protein quan tâm trên các bản gel điện di hai chiều được cắt ra khỏi bản gel, lúc này, phân tử protein nằm trong gel polyacrylamide liên kết với phân tử thuốc nhuộm Coomassie, do đó, để thu được tập hợp các mảnh peptide phục vụ cho phân tích khối phổ, cần loại bỏ chất màu Coomassie và phá vỡ cấu trúc không gian của phân tử protein giúp enzyme trypsin có thể hoạt động. Enzyme trypsin cắt phân tử protein tại các gốc Lysine (K) và Arginine (R) ở đầu C, và khơng cắt tại các vị trí này khi các gốc này được liên kết với Prolin (P). Khi đó, phân tử protein được cắt thành các mảnh peptide (6 - 20 acid amin) thích hợp cho phân tích khối phổ.
Quá trình tẩy màu spot và thuỷ phân protein thành các peptide sẵn sàng cho phân tích khối phổ, bao gồm các bước cụ thể như sau:
Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
- Cắt các spot ra khỏi bản gel. - Rửa các spot bằng nước MiniQ.
- Tẩy màu các spot đã nhuộm coomassie bằng dung dịch chứa ammonium bicarbonate (ABC) 50mM, acetonitrile (AcCN) 50%.
- Làm khô các spot bằng AcCN 100%.
- Nhỏ dung dịch trypsin vào các spot và ủ ở 37oC trong 4 giờ, khi đó, phân tử protein trong các spot sẽ bị thuỷ phân thành các peptide có thể đi ra khỏi gel polyacrylamide.
Các peptide trong dịch thủy phân sẽ được hấp phụ bằng Ziptip C18. Quy trình Ziptip được tiến hành theo các bước sau:
- Làm ướt Ziptip bằng dung dịch có Trifluoroacetic acid (TFA) 0,1% trong AcCN 70%.
- Cân bằng Ziptip bởi dung dịch TFA 0,1%.
- Hấp phụ peptide trong dịch thuỷ phân vào Ziptip. - Loại muối bằng dung dịch TFA 0,1%.
- Phản hấp phụ peptide ra khỏi Ziptip lên đĩa MS bằng dung dịch TFA 0,1% trong AcCN 70%.
- Cuối cùng, bổ sung lên đĩa MS dung dịch matrix (CHCA 10mg/ml trong TFA 0,05%, AcCN 50%).
2.2.7. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein
Tiến hành phân tích khối phổ (MALDI-TOF MS) để xác định khối lượng của tập hợp các peptide thu được sau khi thủy phân mỗi spot protein. Phương pháp khối phổ (MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các hạt mang điện tích hay ion trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Nguồn MALDI được dùng trong phân tích các hợp chất cao phân tử dựa trên nguyên lý làm ion hóa và thăng
LuËn văn cao học Lê Lan Ph-ơng
hoa mẫu peptide từ phức hợp với chất nền (matrix) ở dạng tinh thể qua tác động của các xung laser [1].
Mẫu peptide được phân tích song song với các mẫu chuẩn là hỗn hợp hai peptide: angiotensin II (Mw 1046,5423Da) và insulin B (Mw 3494,6513Da). Hỗn hợp peptide được trộn với chất nền CHCA, để khô và đưa vào máy phân tích khối phổ AXIMA - CRF PLUS (KRATOS ANALYTICAL, Anh). Các thông số hoạt động của máy khối phổ gồm:
- Nguồn laser: 55
- Profile: 30 profile cho một lần bắn - Khối lượng tối ưu: 2000Da
- Phổ khối lượng: 500 - 5000Da
Protein được nhận dạng theo phương pháp Peptide Mass Fingerprint (PMF). Theo phương pháp này, protein được xác định bằng việc so sánh khối lượng của các peptide thu được sau khi thủy phân với cơ sở dữ liệu lý thuyết sẵn có sử dụng phần mềm Mascot để tra cứu theo chế độ sau:
- Cơ sở dữ liệu: NCBInr - Phân loại: Homo sapiens - Enzyme: Trypsin
- Các cải biến không thay đổi: Cacbamidomethyl (C) - Các cải biến thay đổi: Oxidation (M)
- Cho phép sai số: ± 1Da - Giá trị khối: MH+
Luận văn cao häc Lê Lan Ph-ơng
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MƠ GAN
Trong q trình thực hiện đề tài này, chúng tôi tiến hành tách chiết protein từ mơ gan ung thư và mơ gan bình thường (mẫu đối chứng). Mẫu mô được cắt nhỏ, ngâm trong dịch chiết PBS 0,05M pH7,4 và đệm phá tế bào (Lysis) rồi thực hiện các bước ly tâm để thu lấy các phân đoạn dịch chiết protein. Kết quả tách chiết được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE (hình 5).
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
A. Dịch chiết mơ gan bình thường B. Dịch chiết mơ gan ung thư
Hình 5. Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mơ gan bình thường và mơ gan ung thư trên gel polyacrylamide 10% có SDS
(Giếng 1: Dịch chiết PBS1; Giếng 2: Dịch chiết PBS2; Giếng 3: Dịch chiết Lysis1; Giếng 4: Dịch chiết Lysis2; Giếng 5: Dịch chiết Lysis3)
Trong điện di SDS-PAGE, protein được phân tách theo khối lượng phân tử, các protein có khối lượng phân tử khác nhau thì được hiện lên dưới dạng từng băng vạch khác nhau. Hiệu quả tách chiết protein được đánh giá thông qua thành phần và hàm lượng protein thể hiện bằng số lượng các băng và độ đậm nhạt của các băng protein. Khi nhuộm bản gel bằng thuốc nhuộm có chứa Coomassie, băng protein bắt màu thuốc nhuộm càng đậm chứng tỏ hàm lượng protein tại đó càng lớn. Số lượng băng trong một giếng điện di càng nhiều chứng tỏ thành phần protein của mẫu càng đa dạng phong phú.
Luận văn cao häc Lê Lan Ph-ơng
Trong kết quả điện di kiểm tra dịch chiết protein từ mẫu mơ gan (hình 5), chúng tôi thấy trong các giếng đã xuất hiện nhiều băng protein trải đều từ trên xuống dưới, chứng tỏ mẫu dịch chiết protein từ mơ gan có thành phần protein đa dạng. Tuy nhiên, các phân đoạn dịch chiết protein mô gan có độ sạch khác nhau, ở các giếng 1, 3 (hình 5A) và giếng 1 (hình 5B), sự biểu hiện của các băng protein là chưa rõ ràng, hơn nữa, ở các giếng vẫn có hiện tượng kéo vệt dọc.
Do đó, chúng tơi tiến hành tủa mẫu dịch chiết thô bằng dung dịch acetone 100% theo tỉ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch tủa ở -20oC nhằm tập trung protein có trong mẫu, đồng thời loại mỡ và các chất phi protein. Các dịch chiết sau khi tủa được hòa lại bằng đệm lysis và trộn lại với nhau tạo thành dịch chiết protein đầy đủ của mô gan dùng để tiến hành bước thí nghiệm tiếp theo.
3.2. PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU
3.2.1. Phân tách hệ protein mô gan trên bản gel diện di hai chiều
Cho đến nay, kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE) đã trở thành một trong những công cụ phân tách protein được dùng rộng rãi trong các nghiên cứu về hệ protein. Kỹ thuật 2-DE cho phép phân tách các protein khác nhau 0,1 đơn vị pI (isoelectric point) và 1kDa về khối lượng phân tử [37]. Protein trong dịch chiết mơ gan bình thường và mơ gan ung thư cùng được phân tách bằng điện di hai chiều. Trên bản gel điện di, các protein trong mẫu được phân tách thành các spot protein riêng rẽ hoặc các dãy spot của một loại protein, đây là kết quả của việc cải biến protein, có thể do sự sắp xếp ARN hay biến đổi sau dịch mã, tạo ra các đồng phân có khối lượng phân tử tương tự nhau và điểm đẳng điện gần nhau.
Tuy hệ protein mô gan rất phức tạp, song hàm lượng của các protein trong gan khá đồng đều, do đó, các protein được phân tách khá tốt trên bản gel 2-DE (hình 6). Khi phân tách protein mô gan trên bản gel 2-DE sử dụng thanh strip dài 17cm trong khoảng pH 3 - 10 (hình 6A1, B1), kết quả điện di cho thấy các protein đã được phân tách rõ ràng thành các spot riêng rẽ nằm trải khắp bản gel và ít có những vùng tập trung các spot protein có hàm lượng cao bao trùm lên các spot protein
Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
khác. Tuy nhiên, ở vùng giữa bản gel trong khoảng pH 4 - 7, mật độ các spot protein cao, do đó, chúng tơi tiếp tục tiến hành điện di hai chiều sử dụng thanh strip 7cm, pH 4 - 7 để phân tách protein trong khoảng pH này rõ ràng hơn (hình 6A2, B2).
A - Mơ gan bình thường B - Mơ gan ung thư
Hình 6. Phân tách protein mơ gan của bệnh nhân 8460 trên bản gel điện di hai chiều
Chiều 1: Điện di đẳng điện sử dụng thanh IPG strip dài 17cm, pH 3 - 10 (A1 và B1); IPG strip dài 7cm, pH 4 - 7 (A2 và B2); Chiều 2: Điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 10%.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân tách được hệ protein mô gan ung thư và mơ gan bình thường của 6 bệnh nhân HCC trên cả bản gel 2-DE sử dụng thanh strip dài 17cm, pH 3 - 10 và thanh strip dài 7cm, pH 4 - 7. Kết quả điện di phân tách protein mô gan của bệnh nhân HCC trên bản gel 2-DE được thể hiện trong hình 6 và phụ lục 2.
Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
Bước đầu sử dụng phần mềm chun dụng phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều - Phoretix, chúng tôi đã xác định được tổng số spot được phân tách trên
các bản gel 2-DE (bảng 5).