Mã bệnh
nhân
Bản gel 17cm Bản gel 7cm
Mơ bình thường Mơ ung thư Mơ bình thường Mô ung thư
8261 272 spot 171 spot 75 spot 136 spot
8460 329 spot 288 spot 139 spot 123 spot
8935 258 spot 291 spot 53 spot 61 spot
8977 229 spot 254 spot 72 spot 91 spot
9242 275 spot 334 spot 108 spot 155 spot
10480 220 spot 268 spot 145 spot 141 spot
3.2.2. Phân tích biểu hiện của protein trên bản gel điện di hai chiều
Phần mềm chuyên dụng Phoretix cho phép so sánh sự biểu hiện của các
protein thuộc mô gan ung thư so với mô gan bình thường thơng qua sự biểu hiện của các spot trên các bản gel 2-DE. Phần mềm giúp xác định các spot tương ứng trên các bản gel, đưa ra giá trị cường độ khối trung bình của các spot. Ngoài ra, phần mềm cịn đưa ra hình ảnh ba chiều (3-D) của các spot, trong đó, độ lớn của spot được thể hiện bằng bề rộng của đáy spot trên hình 3-D, độ đậm của spot được thể hiện bằng chiều cao của spot tính từ đáy lên đỉnh và độ sắc nét của spot nhuộm màu coomasie được thể hiện bằng độ nhọn của spot ấy trên hình ảnh 3-D (hình 7). Đây là cơ sở để so sánh mức độ biểu hiện của từng spot trên bản gel.
Căn cứ vào các thông số thu được khi phân tích hình ảnh bản gel 2-DE, chúng tơi có thể chỉ ra các spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô ung thư (+); các spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt trên bản gel mơ bình thường (-); các spot biểu hiện tăng (↑) và các spot biểu hiện giảm (↓) ở bản gel mô ung thư so với bản gel mơ bình thường (hình 8).
Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
Hình 7. Hình ảnh 3-D của spot trên bản gel điện di hai chiều
A - Mơ gan bình thường B - Mơ gan ung thư
Hình 8. Minh họa các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thư so với bản gel mơ bình thường
Khi phân tích độc lập từng cặp bản gel, chúng tôi đã xác định được các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mơ gan bình thường trên từng cặp bản gel 2-DE phân tách protein trong khoảng pH 3 - 10, dài 17cm (bảng 6) và phân tách protein trong khoảng pH 4 - 7, dài 7cm (bảng 7). Các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel 2-DE mẫu protein mô gan ung thư so với mơ gan bình thường được minh họa ở hình 9.
Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
- ơ gan bình thường B - ơ gan ung thư
Ghi chú: A1, B1 - Bản gel 2-DE dài 17cm, pH 3 - 10 A2, B2 - Bản gel 2-DE dài 7cm, pH 4 - 7
Hình 9. Các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel 2-DE mẫu mô gan ung thư so với mơ gan bình thường của bệnh nhân HCC mã 8935
A1 B
1
Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
Bảng 6. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mơ gan ung thư so với mơ gan bình thường của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 17cm, pH 3 - 10
8261 8460 8935 8977 9242 10480 ↑ 31 16 51 23 21 39 ↓ 19 33 20 22 27 21 - 7 11 2 4 1 4 + 2 4 7 3 2 5 Tổng 59 64 80 52 51 69
Bảng 7. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mơ gan ung thư so với mơ gan bình thường của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 7cm, pH 4 - 7
8460 8935 8977 9242 10480 ↑ 6 17 18 11 16 ↓ 9 3 10 5 8 - 5 1 1 2 1 + 1 2 3 2 2 Tổng 21 23 32 20 27
Ghi chú: Spot protein biểu hiện tăng (↑); spot protein biểu hiện giảm (↓) ở bản gel mẫu
ung thư so với bản gel mơ bình thường; spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mẫu ung thư (+); xuất hiện mờ nhạt hoặc không thấy trên bản gel mẫu mô ung thư (-).
Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thư so với bản gel mơ gan bình thường của cả 6 bệnh nhân HCC, chúng tơi nhận thấy có 52 spot khác biệt rõ ràng, xuất hiện trên các bản gel mơ gan ung thư so với mơ gan bình thường, bao gồm:
- 6 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô ung thư - 5 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô đối chứng - 23 spot biểu hiện tăng ở bản gel mô ung thư
Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
Khi so sánh hình ảnh các bản gel điện di thu được trong nghiên cứu này với hình ảnh bản gel mơ gan người trong cơ sở dữ liệu SWISS-2D-PAGE [43], chúng tôi nhận dạng được 13 protein tương ứng với 13 spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thư so với bản gel mơ gan bình thường (bảng 8).
Bảng 8. Danh sách các protein biểu hiện khác biệt trên bản gel của mô gan ung thư so với mơ gan bình thường được xác định dựa trên cơ sở dữ liệu EMBL
STT Protein Yếu tố nhận dạng protein Cường độ khối trung bình Biểu hiện ĐC HCC 1 Alpha-1-antitrypsin (Alpha-1-protease inhibitor) (A1AT) P01009 0,0015 0,608 +
2 Protein disulfide-isomerase (PDIA1) P07237 0,738 0,078 ↓
3 Cellular tumor antigen p53 (p53) P04637 0,114 − −
4 Beta-actin, cytoplasmic 1 (ACTB) P60709 0,003 4,599 +
5 Haptoglobin (HPT) P00738 0,002 0,839 +
6 Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) P12004 0,0008 0,265 +
7 Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase (GAPDH/G3P) P04406 0,248 − −
8 Cathepsin D (CATD) P07339 0,0007 0,124 +
9 Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial
(ECHM) P30084 0,0005 0,129 +
10 Superoxide dismutase [Mn],
mitochondrial (SODM) P04179 2,730 0,315 ↓
11 UMP-CMP kinase (KYC) P30085 0,306 0,014 ↓
12 Superoxide dismutase [Cu-Zn] (SODC) P00441 4,524 1,467 ↓
13 Glutamate dehydrogenase 1,
mitochondrial (GDH/ DHE3) P00367 0,686 − −
Ghi chú: ↑, protein biểu hiện tăng; ↓, protein biểu hiện giảm; -, protein không biểu
hiện ở mẫu bệnh; +, protein không biểu hiện ở mẫu mô bình thường; ĐC, bản gel mơ gan bình thường; HCC, bản gel mơ gan ung thư.
Luận văn cao hc Lê Lan Ph-ơng
3.3. NHN DNG PROTEIN BNG PHƯƠNG PHÁP MALDI-TOF MS Sau khi phân tích hình ảnh bản gel 2-DE, những spot protein biểu hiện khác Sau khi phân tích hình ảnh bản gel 2-DE, những spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mơ gan bình thường được cắt và thủy phân, thu được hỗn hợp peptide sử dụng cho phân tích khối phổ. Mỗi protein cho kết quả là một tập hợp dữ liệu về khối lượng của các peptide khác nhau sau khi bị phân cắt bởi enzyme trypsin. Trypsin là một protease thuộc nhóm serine, được sử dụng phổ biến nhất trong phân tích proteomics. Enzyme này phân cắt các protein tại đầu C của lysine và arginine. Thông thường, một protein 50kDa sẽ bị trypsin phân cắt thành 30 đoạn peptide có khối lượng phù hợp để phân tích khối phổ. Một đặc điểm thuận lợi của trypsin đối với phân tích proteomics là enzyme này thể hiện hoạt tính mạnh cả trong dung dịch lẫn khi thuỷ phân trong gel. Bằng kỹ thuật MALDI-TOF MS, chúng tôi đã xác định được các peptide trong mẫu thủy phân protein và biểu thị bằng các đỉnh trên đồ thị (hình 10). Với mỗi đỉnh trên đồ thị, trục hồnh biểu diễn khối lượng/điện tích của peptide (M/Z) và trục tung biểu thị độ lớn của tín hiệu tương ứng peptide đó khi phân tích khối phổ (đơn vị mV).
Hình 10. Phân tích khối phổ các peptide thu được sau khi thủy phân spot protein C-256-B bằng trypsin
Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
Protein được nhận dạng theo phương pháp PMF (Peptide mass fingerprint), khối lượng của peptide được tạo ra sau khi thủy phân được so sánh với cơ sở dữ liệu NCBInr, sử dụng phần mềm Mascot thông qua webside www.matrixscience.com [52]. Kết quả nhận dạng là một danh sách các protein và một số thông tin cơ bản như: tên, ký hiệu, khối lượng phân tử, trình tự peptide phù hợp, sai số,… Tuy nhiên, protein tra được phải có score lớn hơn 64 mới có ý nghĩa (độ tin cậy lớn hơn 99,95%). Thông tin chi tiết về protein tra được gồm: tổng giá trị khối đã tra, số giá trị khối phù hợp với giá trị trong trình tự chuẩn và phần trăm phù hợp trong cơ sở dữ liệu. Ngoài ra, phần mềm cịn đưa ra trình tự amino acid của protein tra được, phần màu đỏ là trình tự của đoạn peptide phù hợp khi tra với cơ sở dữ liệu. Cuối cùng là sự sai khác về khối lượng của các peptide đã tra cứu với khối lượng đã tính tốn biểu thị bằng bảng và đồ thị. Kết quả nhận dạng của spot N97B trên bản gel mẫu mô gan ung thư là ví dụ về nhận dạng protein theo phương pháp PMF (phụ lục 3). Danh sách các protein đã xác định theo phương pháp này được trình bày ở bảng 9.
Bảng 9. Danh sách các protein được xác định bằng MALDI-TOF MS từ bản gel mô gan ung thư so sánh với mô gan đối chứng của bệnh nhân HCC
Spot Tên protein
Yếu tố nhận dạng protein KLPT (Dalton) pI % phù hợp Score Biểu hiện C43C Suppressor of tumorigenicity 7 protein- like (ST7L) Q8TDW4 37.024 8,42 12 73 ↑ C56B Protein disulfide-isomerase A3 (Erp57/ PDIA3) P30101 28.483 5,49 20 71 ↑ C52C Human Mitochondrial Aldehyde Dehydrogenase P05091 54.394 5,7 19 88 ↓ N80A 15 71 ↓ C256B REST corepressor 1
(Protein CoREST) Q9UKL0 47.762 8,23 12 74 ↑
P130B Glutamine synthetase (GS) P15104 42.745 6,43 14 69 ↑
P193B Transcription Factor Ca150 O14776 9.408 9,69 54 85 ↑
P221B Heat shock protein beta-1
(HSPB1/HSP27) P04792 22.826 5,98 24 66 ↓
Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
P71B Apolipoprotein L2 Q9BQE5 45.887 8,79 14 74 ↑
P57D MHC class I antigen Q95460 9600 11,26 30 73 ↓ O167B BAT2 protein (Protein
PRRC2A) P48634 17.081 9,94 25 88 ↑
O244B
Bromodomain and PHD finger containing 1 (Protein
Peregrin)
P55201 59.536 8,66 13 71 ↑
O67B Immunoglobulin G heavy
chain variable region AEX28843 13.503 8,62 59 69 ↑
O301B
Mitochondrial 3-oxoacyl- CoA thiolase (3-ketoacyl-
CoA thiolase)
P42765 42.469 8,51 23 69 ↑
O113
A Zinc finger protein AAC50263 28.889 9,6 20 67 −
O137B AP-2 complex subunit
alpha-1 O95782 106.378 7,75 9 89 ↑
O286B Metastasis related protein AAG27483 10.414 5,43 56 84 ↑
O46D Heterogeneous nuclear
ribonucleoprotein L-like Q8WVV9 49.517 9,01 14 66 −
O285B Peroxiredoxin 2 A6NIW5 15.243 5,82 33 68 ↑
O8D Heat shock protein 60 P10809 61.346 5,7 15 81 ↑
O241B T cell receptor alpha chain AAK37512 13.640 7,88 40 66 ↑
N24B Interleukin-32 P24001 15.127 4,8 23 70 ↑
N97B
Chain A, Crystal Structure Of Human Enolase 1 (Alpha-enolase) P06733 47.481 7,01 18 69 ↑ N296 A Neuropolypeptide h3 (Phosphatidylethanolamine- binding protein 1) P30086 21.027 7,42 41 78 ↓ N35B TFEC protein
(Transcription factor EC) O14948 22.696 9,67 17 71 ↑
N139C Microfibrillar-associated
protein 3 (MFAP3) O75121 34.362 4,9 15 68 ↓
P46D LOC643854 protein AAI01323 61.880 5,45 9 74 ↑ P228A TPA protein Q6LBF5 13.392 7,85 24 72 ↓ P229A Unnamed protein product BAC04847 32.496 8,51 14 70 ↓ P10C Protein FAM180A Q6UWF9 19.834 8,59 16 68 ↓ P15C hCG1989686 EAX08132 11.676 9,55 32 68 ↓ P14A Uncharacterized protein
C12orf45 Q8N5I9 20.168 5,1 20 69 ↓ P48A COMM domain containing 3 Q5T8Z0 18.286 6,14 20 83 ↓
Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
C55D GDDM protein Q86XP7 4.086 10,54 80 71 ↑ C151A Interphase cyctoplasmic
foci protein 45 variant G6DPS4 35.150 8,11 15 68 ↑ O218B IFT172 protein A5PKZ0 60.583 5,66 11 68 ↑ O243B KIAA1179 protein Q9UG01 142.340 5,51 9 67 ↑
N244
A hCG2041492 EAW97522 15.331 5,31 36 66 ↓
Ghi chú: ↑, protein biểu hiện tăng; ↓, protein biểu hiện giảm; -, protein không biểu
hiện ở mẫu bệnh; +, protein khơng biểu hiện ở mẫu mơ bình thường.
Sử dụng kỹ thuật MALDI-TOF MS, chúng tôi đã nhận dạng được 39 spot protein, trong đó có 27 spot tương ứng với 25 protein đã được định danh và 12 protein giả thuyết.
Tóm lại, kết hợp kỹ thuật MALDI-TOF MS và tra cứu cơ ở dữ liệu, chúng tôi đã nhận dạng được 38 protein trên tổng số 52 spot protein biểu hiện khác biêt trên các bản gel mô gan của bệnh nhân HCC.
3.4. THẨM TÁCH MIỄN DỊCH - WESTERN BLOT HAI CHIỀU
3.4.1. Xác định tỷ lệ pha lỗng kháng thể bậc một thích hợp
Kit ECL Advance Western Blotting Detection là kit có độ nhạy cao do tín hiệu phát quang của phản ứng oxy hóa Luminol nhạy và mạnh. Do đó, để giảm liên kết khơng đặc hiệu và tín hiệu nhiễu trên màng cần tối ưu nồng độ kháng thể bậc một và bậc hai khi ủ màng với dung dịch kháng thể.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm để lựa chọn tỷ lệ pha lỗng kháng thể thích hợp. Dịch chiết protein mơ gan ung thư được tra vào 20 giếng trên bản gel điện di SDS-PAGE, 2 giếng được dùng để nhuộm Coomassie G250 để kiểm tra kết quả phân tách mẫu trên gel polyacrylamide (hình 11A), các giếng cịn lại được điện chuyển qua đêm để đưa protein lên màng, sau đó, nhuộm màng bằng thuốc nhuộm Ponceau S để kiểm tra hiệu quả chuyển màng (hình 11B). Trên bản gel nhuộm bằng thuốc nhuộm Coomassie G250 xuất hiện nhiều băng protein bắt màu thuốc nhuộm rõ nét và trải đều dọc theo giếng điện đi, hình ảnh này
Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
khng nh protein ó c phõn tách tốt trên bản gel polyacrylamide. Khi so sánh thành phần protein trên bản gel điện di và màng PVDF, ta thấy các băng protein trên các giếng tương tự nhau chứng tỏ quá trình điện chuyển đạt hiệu suất cao, protein trên gel được chuyển hoàn toàn lên màng.
A B
Hình 11. Phân tách protein chiết từ mơ gan bệnh nhân HCC trên gel polyacrylamide và màng PVDF chuẩn bị cho phản ứng Western Blot
(A - Bản gel polyacrylamide nhuộm Coomassie G250; B - Màng PVDF nhuộm Ponceau S)
Cắt màng thành 9 phần và ủ qua đêm với 8 dung dịch kháng thể bậc một (huyết tương của người bệnh) được pha loãng theo các tỷ lệ khác nhau 1:100; 1:200; 1:300; 1:400; 1:500; 1:600; 1:800; 1:1000. Dung dịch kháng thể bậc hai được pha loãng theo tỷ lệ do nhà sản xuất khuyến cáo là 1:10000. Kết thúc phản ứng Western Blot, hiện tượng phát quang được chụp ảnh (hình 12).
1:100 1:200 1:300 1:400 1:500 1:600 1:800 1:1000
Hình 12. Kết quả phản ứng Western Blot khi ủ màng với dung dịch kháng thể bậc 1 có độ pha lỗng khác nhau
Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
Quan sát hình 12 ta thấy những vạch sáng xuất hiện ở các giếng là vị trí băng protein có tương tác đặc hiệu với kháng thể bậc 1, do đó sẽ liên kết với kháng thể bậc 2 gắn enzyme xúc tác phản ứng phát quang. Các băng sáng xuất hiện trên nền đen càng sắc nét càng đặc hiệu. Tại các giếng được ủ với dung dịch kháng thể bậc 1 có độ pha lỗng là 1:100; 1:200; 1:300; 1:400; 1:500, tuy có xuất hiện băng sáng nhưng băng chưa sắc nét và nền giếng có hiện tượng sáng lóa, điều này có thể do lượng kháng thể bậc 1 dư thừa nên liên kết không đặc hiệu với các protein trên gel. Còn ở các giếng được ủ với dung dịch kháng thể được pha loãng theo tỷ lệ 1:600; 1:800; 1:1000, đặc biệt là giếng được ủ với dung dịch kháng thể pha loãng theo tỷ lệ 1:800, các băng sáng sắc nét, xuất hiện cả băng có khối lượng nhỏ ở phía gần đáy giếng và nền giếng không bị nhiễu sáng.
Từ kết quả thí nghiệm trên, chúng tơi đã lựa chọn tỷ lệ pha loãng dung dịch kháng thể bậc một là 1:800 khi tiến hành các thí nghiệm thực hiện kỹ thuật Western blot tiếp theo.
3.4.2. Kết quả Western Blot hai chiều
Sau khi xác định được tỷ lệ pha lỗng kháng thể bậc một thích hợp, chúng tơi tiến hành thực hiện phản ứng Western blot hai chiều. Các phân tử protein sau khi được phân tách trên bản gel điện di hai chiều 7cm trong khoảng pH 4 - 7 được điện chuyển lên màng. Khi ủ màng với huyết tương của bệnh nhân HCC đã pha loãng 800 lần, các kháng thể trong huyết tương gắn với protein đặc hiệu trên màng, sau đó, tiếp tục ủ màng với kháng thê bậc 2 gắn enzyme xúc tác cho phản ứng hiện màu để phát hiện các spot protein có phản ứng miễn dịch.
Chúng tôi đã thực hiện thành công phản ứng Western blot hai chiều trên bản gel 2-DE mẫu mô gan của 4 bệnh nhân HCC. Kết quả cho thấy trên màng đã xuất