3.4.1. Xác định tỷ lệ pha lỗng kháng thể bậc một thích hợp
Kit ECL Advance Western Blotting Detection là kit có độ nhạy cao do tín hiệu phát quang của phản ứng oxy hóa Luminol nhạy và mạnh. Do đó, để giảm liên kết khơng đặc hiệu và tín hiệu nhiễu trên màng cần tối ưu nồng độ kháng thể bậc một và bậc hai khi ủ màng với dung dịch kháng thể.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm để lựa chọn tỷ lệ pha lỗng kháng thể thích hợp. Dịch chiết protein mơ gan ung thư được tra vào 20 giếng trên bản gel điện di SDS-PAGE, 2 giếng được dùng để nhuộm Coomassie G250 để kiểm tra kết quả phân tách mẫu trên gel polyacrylamide (hình 11A), các giếng cịn lại được điện chuyển qua đêm để đưa protein lên màng, sau đó, nhuộm màng bằng thuốc nhuộm Ponceau S để kiểm tra hiệu quả chuyển màng (hình 11B). Trên bản gel nhuộm bằng thuốc nhuộm Coomassie G250 xuất hiện nhiều băng protein bắt màu thuốc nhuộm rõ nét và trải đều dọc theo giếng điện đi, hình ảnh này
Luận văn cao hc Lê Lan Ph-ơng
khng nh protein ó c phân tách tốt trên bản gel polyacrylamide. Khi so sánh thành phần protein trên bản gel điện di và màng PVDF, ta thấy các băng protein trên các giếng tương tự nhau chứng tỏ quá trình điện chuyển đạt hiệu suất cao, protein trên gel được chuyển hoàn toàn lên màng.
A B
Hình 11. Phân tách protein chiết từ mơ gan bệnh nhân HCC trên gel polyacrylamide và màng PVDF chuẩn bị cho phản ứng Western Blot
(A - Bản gel polyacrylamide nhuộm Coomassie G250; B - Màng PVDF nhuộm Ponceau S)
Cắt màng thành 9 phần và ủ qua đêm với 8 dung dịch kháng thể bậc một (huyết tương của người bệnh) được pha loãng theo các tỷ lệ khác nhau 1:100; 1:200; 1:300; 1:400; 1:500; 1:600; 1:800; 1:1000. Dung dịch kháng thể bậc hai được pha loãng theo tỷ lệ do nhà sản xuất khuyến cáo là 1:10000. Kết thúc phản ứng Western Blot, hiện tượng phát quang được chụp ảnh (hình 12).
1:100 1:200 1:300 1:400 1:500 1:600 1:800 1:1000
Hình 12. Kết quả phản ứng Western Blot khi ủ màng với dung dịch kháng thể bậc 1 có độ pha lỗng khác nhau
Luận văn cao học Lê Lan Ph-ơng
Quan sát hình 12 ta thấy những vạch sáng xuất hiện ở các giếng là vị trí băng protein có tương tác đặc hiệu với kháng thể bậc 1, do đó sẽ liên kết với kháng thể bậc 2 gắn enzyme xúc tác phản ứng phát quang. Các băng sáng xuất hiện trên nền đen càng sắc nét càng đặc hiệu. Tại các giếng được ủ với dung dịch kháng thể bậc 1 có độ pha lỗng là 1:100; 1:200; 1:300; 1:400; 1:500, tuy có xuất hiện băng sáng nhưng băng chưa sắc nét và nền giếng có hiện tượng sáng lóa, điều này có thể do lượng kháng thể bậc 1 dư thừa nên liên kết không đặc hiệu với các protein trên gel. Còn ở các giếng được ủ với dung dịch kháng thể được pha loãng theo tỷ lệ 1:600; 1:800; 1:1000, đặc biệt là giếng được ủ với dung dịch kháng thể pha loãng theo tỷ lệ 1:800, các băng sáng sắc nét, xuất hiện cả băng có khối lượng nhỏ ở phía gần đáy giếng và nền giếng không bị nhiễu sáng.
Từ kết quả thí nghiệm trên, chúng tơi đã lựa chọn tỷ lệ pha loãng dung dịch kháng thể bậc một là 1:800 khi tiến hành các thí nghiệm thực hiện kỹ thuật Western blot tiếp theo.
3.4.2. Kết quả Western Blot hai chiều
Sau khi xác định được tỷ lệ pha lỗng kháng thể bậc một thích hợp, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng Western blot hai chiều. Các phân tử protein sau khi được phân tách trên bản gel điện di hai chiều 7cm trong khoảng pH 4 - 7 được điện chuyển lên màng. Khi ủ màng với huyết tương của bệnh nhân HCC đã pha loãng 800 lần, các kháng thể trong huyết tương gắn với protein đặc hiệu trên màng, sau đó, tiếp tục ủ màng với kháng thê bậc 2 gắn enzyme xúc tác cho phản ứng hiện màu để phát hiện các spot protein có phản ứng miễn dịch.
Chúng tôi đã thực hiện thành công phản ứng Western blot hai chiều trên bản gel 2-DE mẫu mô gan của 4 bệnh nhân HCC. Kết quả cho thấy trên màng đã xuất hiện các điểm sáng sắc nét (hình 13 và phụ lục 4), đây chính là vị trí của các spot protein có tính kháng ngun. Cường độ sáng của từng điểm là tiêu chí đánh giá mức độ biểu hiện và đáp ứng miễn dịch của protein trên màng. Hình ảnh Western blot
Lun vn cao hc Lê Lan Ph-ơng
c so sánh với bản gel 2-DE 7cm được nhuộm Coomassie G250 nhằm xác định các protein có tính kháng ngun.
A - Mơ gan bình thường B - Mơ gan ung thư
Hình 13. Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của bệnh nhân 8977
Dựa vào vị trí tương ứng của các spot phát sáng trên màng PVDF với các spot trên bản gel 2-DE dài 7cm và kết quả định danh protein, chúng tôi đã xác định được 4 protein trong mơ gan của bệnh nhân có phản ứng miễn dịch với kháng thể trong huyết tương của chính bệnh nhân đó là: protein ST7L biểu hiện tăng và protein MHC lớp I, HSP27, aldehyde dehydrogenase biểu hiện giảm ở mô gan ung thư so với mơ gan bình thường.