4.2.5.3.1. Tăng sinh
Tăng sinh: lấy 25 g mẫu cho vào túi dập mẫu, thêm 225 ml canh Tryptone Soya, đồng nhất mẫu, đo pH và chỉnh về 7± 0,2, buộc chặc miệng túi, ủ ở 37oC trong 16 - 20 giờ.
Tăng sinh chọn lọc: chuyển 0,1 ml dịch tăng sinh sang 10 ml canh tăng sinh GN, ủ ở 37oC trong 16 - 20 giờ.
Dùng que cấy vòng cấy dịch tăng sinh lên các đĩa môi trường thạch chọn lọc. Sử dụng ít nhất hai loại môi trường thạch phân lập khác nhau, một số môi trường thông dụng như: T7A, XLD, HE, MAC,…
Ủ các đĩa môi trường ở nhiệt độ 37oC trong 24 - 48 giờ. Biểu hiện của Shigella trên các môi trường phân lập như sau:
Môi trường T7A: khuẩn lạc Shigella có màu xanh nhạt.
Môi trường HE: khuẩn lạc Shigella có màu xanh nhạt, trong suốt.
Môi trường XLD: khuẩn lạc Shigella có màu đỏ, trong suốt.
Môi trường MAC: khuẩn lạc Shigella có màu nâu đỏ, trong suốt.
4.2.5.3.3. Khẳng định Shigella bằng thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh
Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập, cấy lên môi trường thạch không chọn lọc, ủ ở 37oC trong 20 - 24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng để tiến hành các thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh.
Thử nghiệm sàng lọc:
Cấy ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường TSI, cách cấy như sau: trước hết cấy ria trên mặt nghiêng, sau đó đâm sâu xuống ống nghiệm.
Khẳng định Shigella: Shigella cho màu đỏ trên mặt nghiêng, màu vàng ở phần đáy ống nghiệm và không tạo H2S trong môi trường.
Thử nghiệm khẳng định :
Shigella được khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa ứng với các kết quả:
Thử nghiệm sinh hóa Kết quả Thử nghiệm sinh hóa Kết quả
Simmon citrate - Salicine -
Arginine decarboxylase - Xylose -
Lisine decarboxylase - Cellobiose
Urease - Adonitol -
Malonate - Dulcitol -
MR + Inositol -
VP -
4.2.5.3.4. Khẳng định Shigella bằng thử nghiệm kháng huyết thanh
Thực hiện thử nghiệm kháng huyết thanh bằng huyết thanh đa giá A, B, C, D từ các dòng được nuôi cấy trên môi trường thạch không chọn lọc.
Tiến hành song song với mẫu đối chứng (dùng nước muối sinh lí).
Phản ứng (+) khi chủng thử nghiệm tạo ngưng kết với kháng huyết thanh nhưng không có ngưng kết với nước muối sinh lý.
4.2.5.3.5. Báo cáo kết quả