Qui trình phân tích định tính Salmonella trong thực phẩm

Đối với các loại mẫu thông thường:

Ÿ Cân 25 g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225 ml dung dịch BPW.

Ÿ Đồng nhất mẫu bằng Stomacher và ủ ở 37 ±

1oC trong 18 - 24 giờ.

Đối với một số thực phẩm có chứa các chất có thể gây độc hoặc ứng chế sự tăng trưởng của Salmonella, cần thực hiện qui trình tăng sinh đặc biệt:

Ÿ Đối với mẫu gia cầm tươi sống: đặt mẫu vào bao PE lớn, thêm 1 lít môi trường tăng sinh BPW, lắc bằng máy lắc khoảng 30 giây để môi trường thấm được vào trong toàn bộ mẫu.

Ÿ Đối với sữa khô: cho 25 g mẫu vào túi PE vô trùng, thêm 225 ml môi trường BPW, để yên 60 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó lắc cho sữa tan hết.

Ÿ Đối với dừa và các mẫu có hàm lượng chất béo cao: đồng nhất mẫu với BPW, thêm vào 2 - 3 giọt Triton X - 100 và ủ tăng sinh.

4.2.4.3.2. Tăng sinh chọn lọc

Lắc đều dịch tăng sinh, chuyển 0,1 ml sang 10 ml môi trường tăng sinh RV đã được ủ ấm đến 42oC. Ủ ở 42oC ±

0,2oC trong 18 - 24 giờ.

Mỗi môi trường tăng sinh chọn lọc được ủ ở một nhiệt độ nuôi cấy khác nhau và mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng trên một đặc điểm phát triển của Salmonella.

4.2.4.3.3. Phân lập và nhận diện

Dùng que cấy vòng cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc như XLD, HE, …

Các biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường chọn lọc khác nhau là khác nhau, thể hiện ở hình thái khuẩn lạc Salmonella, ví dụ:

Ÿ Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hoặc không có tâm đen.

Ÿ Môi trường HE: khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hoặc không có tâm đen.

Ÿ Môi trường BS: khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kim tím. Môi trường xung quanh khuẩn lạc chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển màu đen nếu kéo dài thời gian ủ.

Ÿ Môi trường BPLS: khuẩn lạc màu hồng nhạt, trong suốt, xung quanh khuẩn lạc môi trường có màu đỏ. Sau khi cấy, các đĩa được ủ ở 37oC trong 22 - 26 giờ.

4.2.4.3.4. Khẳng định

Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc bị nghi ngờ là Salmonella, cấy sang môi trường không chọn lọc, ủ 37oC trong 18 - 24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được dùng cho các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh.

Các chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm sinh hóa như sau:

Ÿ Thử nghiệm H2S (TSI hay KIA): xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường, có hiện tượng làm vỡ thạch môi trường (do sinh hơi).

Ÿ Thử nghiệm LDC (+): môi trường chuyển thành màu như ban đầu.

Ÿ Thử nghiệm Urea (-): môi trường giữ nguyên màu vàng cam.

Ÿ Lên men mannitol, sorbitol (+): môi trường chuyển sang màu vàng.

Ÿ Thử nghiệm Indol và VP: (-).

Các thử nghiệm kháng nguyên được thực hiện song song với mẫu đối chứng bằng dung dịch nước muối sinh lý. Phản ứng (+) khi chủng thử nghiệm tạo ngưng kết với kháng huyết thanh nhưng không có ngưng kết với nước muối sinh lý.

4.2.4.3.5. Báo cáo kết quả

Báo cáo kết quả là “có” hay “không có” Salmonella trong 25 g mẫu.

4.2.5. Shigella

4.2.5.1. Định nghĩa và nguyên tắc

nghiệm catalase (+), lên men glucose không sinh hơi, không lên men lactose, không sinh H2S, không có enzyme lysine decarboxylase.

Giống Shigella gồm 4 loài:

Ÿ S. dysenteriae không lên men mannitol, thuộc nhóm kháng huyết thanh A.

Ÿ S. flexneri thuộc nhóm kháng huyết thanh B.

Ÿ S. boydii lên men mannitol sinh hơi, thuộc nhóm kháng huyết thanh C.

Ÿ S. sonnei lên men mannitol, thuộc nhóm kháng huyết thanh D.

Shigella là tác nhân gây bệnh shigellosis, là bệnh nguy hiểm lây lan rất nhanh từ người sang người qua đường thực phẩm

(thịt băm, thủy sản,..) và nước uống. Shigella gây ngộ độc thực phẩm với liều lượng là rất thấp.

Shigella được phát hiện bằng cách cấy một lượng mẫu xác định vào môi trường lỏng không chọn lọc, sau đó chuyển vào

môi trường tăng sinh chọn lọc. Dịch khuẩn sau khi tăng sinh chọn lọc được cấy phân lập trên ít nhất 2 đĩa môi trường thạch khác nhau. Khuẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra bằng thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanh.

4.2.5.2. Môi trường và hoá chất

Canh Tryptose Soya và Gram Negative (GN). Dulcitol Phenol Red Broth (DPR).

Mannitol Phenol Red Broth (MPR).

Thạch Hektoen Enteric (HE) và Triple Sugar Iron (TSI). Thạch Deoxycholate Citrat Agar.

Thạch MacConkey (MAC) và Xylose Lysine Desoxycholate (XLD). Môi trường Tergitol - 7 Agar (T7A).

Môi trường thử nghiệm tính di động. Thuốc thử oxidase và catalase.

Kháng huyết thanh gồm 4 loại: polyvalent A, B, C, D.