Định lượng S aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Cân chính xác 10 ±

0,1 g mẫu ttrong túi PE vô trùng, thêm 90 ml dung dịch pha loãng, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây.

Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp, sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa BPA sẽ xuất hiện khoảng 10 - 100 khuẩn lạc / đĩa.

4.2.3.4.2. Phân lập trên môi truờng chọn lọc

Cấy 0,1 ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường BPA.

Dùng que cấy tam giác thủy tinh trải đều mẫu lên bề mặt môi trường cho đến khi khô. Cấy mẫu trên 3 đĩa môi trường BPA có độ pha loãng khác nhau. Thực hiện tương tự với môi trường thạch máu.

Lật ngược đĩa, ủ ở 37 ±

1oC trong 24 - 48 giờ đối với môi trường BPA và 24 giờ đối với môi trường thạch máu. Trên môi trường thạch BPA:

Ÿ Sau 24 giờ, khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 0,5 - 1 mm, lồi, đen bóng có vòng sáng rộng khoảng 1 - 2 mm bao quanh. Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm trên và tiếp tục ủ đến 48 giờ.

bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng 2 - 4 mm quanh khuẩn lạc. Có một số dòng S. aureus có thể không tạo

các vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên. Cần đếm và đánh dấu cả hai dạng khuẩn lạc.

Trên môi trường thạch máu, sau 24 giờ ủ, S. aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục, lồi có màu xám hay vàng nhạt, đường kính 1 - 2 mm.

4.2.3.4.3. Khẳng định

Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng từ môi trường thạch BPA lên môi trường thạch TSA, ủ ở 37oC.

Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. Tính tỉ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng. Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu.

Kết quả thử nghiệm là (+) khi có khối dòng huyết tương hình thành (mọi mức độ đông kết đều được xem là (+)). Kết quả là (-) khi không có

hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy.

4.2.3.4.4. Cách tính kết quả

Mật độ S. aureus trong mẫu được tính như sau:

Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = [ 10 (NtHt + NaHa) ] / ( F1 + F2) Trong đó: F: độ pha loãng.

Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng.

Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng.

Ht: tỉ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với khuẩn lạc đặc trưng.

Ht: tỉ số giữa số khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với khuẩn lạc không đặc trưng.