Để có thể phân loại chính xác đến loài, chúng tôi tiến hành xác định trình tự gen mã hoá ARNr 16S của các chủng nghiên cứu.
Các chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP_4 thạch nghiêng, lấy hai vòng que cấy và tách chiết qua nhiều bước (theo phương pháp tách chiết ADN tổng
số như đã nêu). Kiểm tra sản phẩm điện di trên gel agarose 1% cho thấy trên bản gel thu được băng ADN duy nhất.
Trong ADN tổng số được tách chiết có gen mã hoá ARNr 16S của các chủng nghiên cứu. ADN này được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR để nhân gen ARNr 16S lên nhiều lần bằng các cặp mồi đã thiết kế. Với cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự bảo thủ của gen mã hoá ARNr 16S của E. coli thì theo lý thuyết sản phẩm PCR thu được phải có độ dài xấp xỉ 1500bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy các băng có kích thước khoảng 1500bp đúng như lý thuyết. Băng ADN rất rõ, không bị đứt gãy, cóđộ tinh sạch cao, có thể sử dụng trong các phản ứng tiếp theo. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit vivapure theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR được kiểm tra hàm lượng ADN và độ tinh sạch. Sau đó sản phẩm này được khuếch đại tiếp với các mồi và các hóa chất của bộ kit Cycle sequenxing để chuẩn bị xác định trình tự.
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR
1. Marker, 2: TN6.5.1, 3: XK9, 4: XK12, 5: HC12, 6: TN4.2.2, 7: TN4.2.1, 8: TN4.4.1, 9: TN2.4.9, 10: XK5
Trình tự nucleotit của đoạn gen mã hoá ARNr 16S được xác định bằng máy giải trình tự tự động ABI 3100 Avant của hãng Perkin-Elmer (Mỹ). Sau đó chuỗi trình tự này được so sánh với các trình tự nucleotit ADNr 16S đãđược công bố trên ngân hàng gen quốc tế ( http: //www.ncbi.nlm.nih.gov ) bằng chương trình BLAST.
Chủng XK5 có độ tương đồng 99% so với chủngStreptomyces misionensis