M Ở ĐẦU
1.3.2.4. Tiến hành sắc ký
- Chuẩn bị dụng cụ và máy móc:
+ Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy hoạt động tốt cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng... Đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra.
+ Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách, và rửa đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký.
- Chuẩn bị dung môi pha động:
Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết HPLC các hóa chất dùng phải là loại PA. Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ…
- Chuẩn bị mẫu đo HPLC:
+ Mẫu thử: xử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận, qui trình theo nguyên tắc: - Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu.
- Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng cách lọc hay chiết.
- Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0,2-0,45 µm.
- Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột. Nồng độ vượt quá khả năng tách của cột có thể gây ra nghẽn cột.
+ Mẫu chuẩn:
Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần.
- Cách đo HPLC:
Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm sắc ký. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc sau:
+ Chạy máy với dung môi pha động để đuổi khí. + Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như:
* Cấu hình máy.
* Tỷ lệ các dung môi pha động.
* Bước sóng, thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích theo yêu cầu.
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU