M Ở ĐẦU
1.3.2.1. Cơ sở lý thuyết
Trong sắc ký, mẫu phân tích ở trạng thái lỏng được nạp vào cột. Cột sắc ký có tiết diện nhỏ, cột hẹp chứa chất nhồi hay chất nền. Dung môi được bơm qua cột, tạo nên quá trình rửa giải từ đầu cột đến cuối cột và sau đó đến detector. Sự tương tác khác nhau của các thành phần khác nhau có trong mẫu phân tích với pha tĩnh ảnh hưởng đến quá trình tách. Điều này thấy trong hình 1.5, hỗn hợp của các phân tử A và C đã được nạp vào đầu cột.
Trong lúc di chuyển với dung môi (pha động), A và C tách rời khỏi nhau vì C có ái lực lớn hơn với pha tĩnh và kết quả di động qua cột chậm hơn A. Kết quả cuối cùng A giải hấp (Elute) khỏi cột trước sau đó đến C. Việc đo độ hấp thụ và một vài đặc tính khác được dựa trên Sắc ký đồ biểu thị thời gian dung lượng giải hấp, như thấy ở hình 1.6 đối với các phân tử có ghi ở hình 1.5 [5].
Hình 1.6: Sắc ký đồ của quá trình phân tách ở Hình 1.5
Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ:
+ Thời gian lưu chết (dead time) [5]:
- Phần lớn các phân tử hữu cơ có phổ hấp thụ ở vùng tử ngoại thấp (210 nm) và sự hấp giải thường được theo dõi bằng phép đo quang phổ. Dung lượng thấm hay dung lượng pha động VM là dung lượng của pha động trong cột. Dung lượng này là tổng của chất lỏng bên ngoài (V0) và bên trong thành cột (Vi ).
- VM là lượng chất lỏng cần cho đỉnh không lưu giữ đi qua cột, đại lượng này dùng để ứng dụng làm điểm tham khảo khi tách bằng sắc ký, “t0” là thời gian lưu chết (dead time), “VM” hay “t0” của một cột có thể xác định bằng nhiều cách, cho một lần hoạt động nào đó.
VM 0,5.L.dc Trong đó: L là chiều dài của cột (cm).
c
- Đối với một cột có đường kính bên trong 4,6 mm thì VM là khoảng một phần mười chiều dài.
F V t M 0 Trong đó: F là tốc độ dòng chảy (mL/phút).
- Đối với một cột có chiều dài 250 mm, đường kính bên trong 4,6 mm, tốc độ chảy là mL/phút, thời gian chết khoảng 2,5 phút.
+ Thời gian lưu giữ (retention time):
- Dung lượng duy trì (retention) VR là khối lượng dung môi đi qua cột từ lúc tiêm mẫu phẩm đến lúc phát hiện đỉnh (peak) đo ở điểm chóp (apex) của nó như chóp ở hình 1.6. Nếu lưu lượng dòng chảy thường không đổi trong thời gian tách. Khi đó có thể dễ dàng chuyển đổi lẫn nhau giữa thời gian và lượng dung môi giải hấp. Vậy VR cho một thành phần đặc biệt là liên kết với thời gian riêng biệt, được gọi là thời gian lưu giữ tR, nó liên quan đến tốc độ chảy [5].
VR F.tR
Trong đó: F là tốc độ dòng chảy theo khối lượng, thường là mL/phút.
- Thời gian lưu giữ của mỗi chất là một hằng số xác định và các chất khác nhau thì thời gian lưu giữ sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn. Vì vậy thời gian lưu giữ là đại lượng để phát hiện định tính các chất [7].
- Thời gian lưu giữ phụ thuộc vào các yếu tố: + Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
+ Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động. + Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.
+ Trong một số trường hợp thời gian lưu giữ còn phụ thuộc vào pH của pha động.
Trong một phép phân tích nếu tR nhỏ quá thì sự tách kém còn nếu tR quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém.
+ Hệ số dung lượng (capacity factor) [7]:
- Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng:
0 0 ' t t t V V V k R M M R
- Nếu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu k’ lớn thì peak bị doãng. Trong thực tế k’ từ 1-5 là tối ưu.
+ Hệ số chọn lọc [5]:
- Khả năng tách của một pha tĩnh là phân biệt giữa hai phân tử. Hệ số chọn lọc ( ) được xác định là tỷ lệ của hệ số dung tích của hợp chất lưu giữ lâu nhất so với hợp chất lưu giữ ít nhất:
1 2 k k
- Hệ số chọn lọc phụ thuộc bởi các cấu trúc lý học và hóa học của mẫu phân tích, pha tĩnh và pha động. Tính chọn lọc không thể thay đổi được khi điều chỉnh tốc độ chảy hay kích thước của cột, có thể thay đổi đáng kể độ chọn lọc bằng cách thay đổi pha động với một hay một vài tính chất khác nhau. Trong nhiều trường hợp, cần thay đổi pha tĩnh bảo đảm sự chọn lọc để có thể tách được hai đỉnh. Tính chọn lọc là yếu tố quan trọng nhất để có được sắc ký đồ thành công.
+ Độ phân giải (resolution):
- Mục đích của sắc ký là tách các đỉnh. Độ phân giải (Rs) của hai đỉnh như ghi ở hình 1.7 có thể xác định về lượng tính:
1 2 2 1 2 w w t R s t
Trong đó w2và w1 là độ rộng của đỉnh, đo ở đáy của chúng trong cùng đơn vị thời gian [5].
- Trong thực tế nếu các peak cân đối thì độ phân giải để 2 peak tách là Rs bằng 1,0 trong phép định lượng Rs = 1,5 là phù hợp. Nếu Rs nhỏ quá thì các peak chưa tách hẳn, việc tính toán diện tích peak sẽ không chính xác. Nếu Rs lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ nhạy sẽ kém. Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình Gradient dung môi. Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký dùng chương trình dung môi thì một số pha động có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu giữ và diện tích của các peak ta phân tích [7].
Hình 1.7: Các thông số chính của quá trình sắc ký lỏng cơ bản
Kết quả tách của hai đỉnh có thể đánh giá bằng quan sát mà không cần tính độ phân giải như ghi ở các sơ đồ sắc ký lý tưởng hóa trong hình 1.8.
- Có thể thấy là các đỉnh ở dãy đáy là hoàn toàn tách khỏi nhau và các đỉnh ở dãy bên trên chỉ được tách ra một phần. Với độ phân giải bằng 1, sự hiện diện của hai (hay nhiều) đỉnh đều có thể phân biệt, các đỉnh có thể định lượng với mức tách 98% gần đường baseline. Khi độ phân giải nhỏ hơn 1, các hợp phần nhỏ có thể bị che khuất bởi hợp phần lớn, như thấy ở ví dụ phía trên. Nhóm bên trái có hai hợp chất với độ rộng dải bằng nhau và cũng đáp ứng bởi detector giống nhau với độ phân giải khác nhau từ 0,6 đến 1,25. Nếu độ phân giải nhỏ hơn 0,6 kết quả tách một phần nhỏ hay có thể coi như kết quả hơn một đỉnh [5].
+ Hiệu năng:
- Hiệu năng được đo lường khi một hợp chất di chuyển qua một cột (cụ thể hơn là sự di chuyển vào và đi ra đối với pha động và pha tĩnh). Nó là một tham số động học. Hiệu năng là một tính toán thống kê về độ lệch tiêu chuẩn của đỉnh trong đơn vị thời gian và được đo bằng các đĩa lý thuyết (N):
2 R t N
Trong đố là độ lệch tiêu chuẩn của dải trong một đơn vị thời gian, nó có thể được tính bằng bề rộng của đỉnh ở đường đáy (w) hay nửa chiều cao [5].
- Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là h, lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động.
Chiều cao h phụ thuộc vào các yếu tố:
+ Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh. + Tốc độ và độ nhớt (độ phân cực) của pha động. + Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột.
Vì vậy với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao h cũng là một hằng số xác định đối với một chất phân tích [7].
+ Hệ số không đối xứng (tailing factor) [5]:
- Tuy đỉnh sắc ký theo lý tưởng phải đối xứng, nhưng chúng thường không đối xứng với một trục rơi từ ngọn xuống đáy. Nguyên nhân gây ra bởi nhiều yếu tố: chất nền trong cột không đồng nhất, trong cột sự hấp thụ không đặc trưng ở pha tĩnh hay các vấn đề ở pha động hoặc mẫu phân tích.
Hình 1.9: Tính không đối xứng của peak
- Hệ số không đối xứng của đỉnh (As) được xác định theo công thức sau:
a b As
Khi As≤ 2,5 thì phép định lượng được chấp nhận.
Khi As > 2,5 thì điểm cuối của peak rất khó xác định vì vậy cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để peak cân đối hơn.