2.5.3.4 Đọc và tính tốn kết quả.
Hàm lƣ ng đƣờng khử tổng số (X2), t nh ằng % khối lƣ ng theo công thức:
Trong đó:
a2 - Khối lƣ ng đƣờng chuyển hoá sau thuỷ ph n, t nh theo ảng Bertrand V1 - Thể t ch nh định mức chứa dung dịch A, ml V3 - Thể t ch nh định mức chứa dung dịch C, ml A) Dung dịch sau khi để nguội B) Dung dịch sau trung hòa
35 10 - Thể t ch dung dịch A đem pha, ml
25 - Thể t ch dung dịch đem thuỷ ph n, ml. m - Khối lƣ ng mật ong mẫu, (g)
1000 - Hệ số đổi ra mg
Hàm lƣ ng đƣờng Saccharose (X) trong mật ong, t nh ằng % khối lƣ ng, theo công thức:
X = (X2 – X1).0,95 Trong đó:
X1 - Hàm lƣ ng đƣờng khử tự do, t nh ằng % khối lƣ ng của đƣờng khử tự do
0,95 - Hệ số từ chuyển đổi từ đƣờng khử ra đƣờng Saccharose
2.5.4 ương p áp xác định ho t l c Diastase mật ong b c hà theo TCVN 5268:2008
2.5.4.1 Mục đích của thử nghiệm.
Mục đ ch là để xác định xem hoạt lực Diastase có trong mẫu mật ong bạc hà ở cả 2 thời điểm thu hoạch đầu vụ và cuối vụ.
2.5.4.2 Cơ sở sinh hóa.
Dung dịch tinh bột - mật ong hồ tan có t nh đệm đƣ c ủ ấm và thời gian cần để đạt đƣ c điểm kết thúc qui định đƣ c xác định bằng máy đo quang. Các kết quả đƣ c biểu thị bằng mililit tinh bột 1 % đã thuỷ phân bằng enzym trong 1g mật ong trong thời gian 1 giờ.
2.5.4.3 Cách tiến hành thí nghiêm.
Cân 10 g phần mẫu thử cho vào cốc thủy tinh, hoà tan trong 10 ml đến 15 ml nƣớc và 5 ml dung dịch đệm
Chuyển vào nh định mức 50 ml chứa 3 ml dung dịch natri clorua. Thêm nƣớc đến vạch [dung dịch phải cho đệm trƣớc khi bổ sung vào dung dịch natri clorua (Hoà tan 14,5 g natri clorua trong nƣớc và pha loãng bằng nƣớc đến 500 ml).
36
Cân 2.000 g tinh bột tan (dùng riêng cho việc xác định hoạt lực diastaza, sẵn có từ một số nhà cung cấp) và trộn đều với 90 ml nƣớc trong bình nón 250 ml . Đun nhanh dung dịch đến điểm sôi, khuấy dung dịch càng nhanh càng tốt. Giảm nhiệt độ và để cho dung dịch sôi nhẹ trong 3 min, đậy nắp và để nguội đến nhiệt độ phòng. Chuyển dung dịch vào nh định mức 100 ml và pha loãng đến vạch. Các chi tiết quan sát đƣ c gần với dao động giới hạn hệ số hấp thụ (A) của hỗn h p tinh bột tốt.
Dùng pipet lấy 5 ml dung dịch tinh bột cho vào 10 ml nƣớc và trộn đều. Dùng pipet lấy 1 ml dung dịch này cho vào một số dụng cụ chứa có chia độ chứa 10 ml dung dịch iot đã pha loãng. Trộn đều và xác định độ pha lỗng cần thiết để có đƣ c hệ số hấp thụ A trong khoảng 0,760 ± 0,02. Ghi lại giá trị này là dung dịch pha loãng chu n đƣ c d ng để chu n bị hồ tinh bột. L p lại qui trình khi nguồn tinh bột thay đổi.
Dùng pipet hút 5 ml dung dịch tinh bột cho vào ống nghiệm và 10 ml dung dịch thử nghiệm vào nh tam giác, không đƣ c trộn. Cho ống vào nồi cách thuỷ trong 15 phút ở 40 oC ± 2 oC. Sau đó trộn đều lƣ ng chứa trong ống nghiệm và bình tam giác. Bắt đầu bấm giờ. Sau 5 phút, dùng pipet lấy ra 1 ml dịch lỏng cho vào dụng cụ chứa có chia vạch đã có sẵn 10 ml dung dịch iot loãng. Trộn đều, pha lỗng đến thể t ch xác định, sau đó xác định hệ số hấp thụ A trong máy đo phổ. Ghi lại thời gian từ khi trộn tinh bột và mật ong đến khi lấy ra cho vào dung dịch iot, đ y là thời gian phản ứng. Để pipet 1 m vào ống phản ứng để dùng lần sau. Cứ 5 min một lần lấy 1 ml dung dịch lỏng ra cho đến khi thu đƣ c giá trị độ hấp thụ A < 0,235.
37
A) B)
C) D)
Hình 2.3. Các hỗn h p dùng đo độ hấp thụ
A) Mẫu thử trong nh định B) Mẫu thử
C) Hỗn h p tinh bột D) Dung dịch pha loãng chu n
2.5.4.4 Đọc kết quả.
Bảng 2.2 cho biết giá trị hấp thụ A tƣơng ứng với thời gian của điểm kết thúc.
38
Vẽ đồ thị sự phụ thuộc của hệ số hấp thụ A dựa vào thời gian (min) trên giấy kẻ ô li, nối đƣờng thẳng giữa các điểm đi qua hệ số hấp thụ A càng nhiều điểm càng tốt.
Từ đồ thị, xác định thời gian của hỗn h p phản ứng khi giá trị A = 0,235. Lấy 300 chia cho giá trị thời gian để thu đƣ c chỉ số Diastase (DN)
2.5.5 ương p áp đán g á k ả năng k áng k uẩn c a mật ong b c hà bằng p ương p áp k uếch tán trên giếng th ch
2.5.5.1 Mục đích của thử nghiệm.
Mục đ ch là để xác định khả năng kháng lại các chủng vi khu n của mẫu mật ong bạc hà ở cả 2 thời điểm thu hoạch đầu vụ và cuối vụ.
2.5.5.2 Cơ sở sinh hóa.
Do sự chênh lệch áp suất th m thấu giữa bên trong và bên ngoài của vi sinh vật, làm cho nƣớc ở trong tế bào vi sinh vật đi ra ngoài g y nên hiện tƣ ng co nguyên sinh, ngăn cản sự trao đổi chất của vi sinh vật, gây ức chế ho c tiêu diệt vi sinh vật.
2.5.5.3 Cách tiến hành thí nghiệm.
Hoạt tính kháng khu n của mật ong bạc hà đƣ c đánh giá ằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch dựa trên phƣơng pháp của Anonymous (1996) và Hadacek, ctv (2000) có sự điều chỉnh cho phù h p với điều kiện của phịng thí nghiệm.
Hịa tan TSB ho c HI trong nƣớc cất, sau đó d ng pipet hút 20ml mơi trƣờng đã pha vào 20 chai có thủy tinh thể t ch 50 ml trong đó có 5 chai đƣ c thêm 0,3 g NaCl vào từng chai. Dùng bông không thấm làm nút đậy và dùng giấy báo bao lại trên nấp chai. Hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút.
Sau khi hấp môi trƣờng đƣ c làm nguội ở nhiệt độ phòng.
Dùng micropipet hút 100 ml dịch sinh khối vi khu n chỉ thị vào từng chai môi trƣờng đã chu n bị trƣớc. Đem lắc 24 giờ (150 vòng/phút).
C n và hịa tan mơi trƣờng TSA ho c BHI agar trong nƣớc cất, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút và tiến hành đỗ môi trƣờng ra đĩa petri vô tr ng đã
39
chu n bị trƣớc. Ngoài ra tiến hành đỗ mơi trƣờng có chứa 15 g/l NaCl ra đĩa petri vô trùng.
Tiến hành đo OD ƣớc song 600 nm dịch tăng sinh vi khu n chỉ thị sau 24 giờ tăng sinh. D ng nƣớc muối sinh l pha loãng đến nồng độ 10-7.
Dùng micropipet hút 100 ml dịch vi khu n đã pha loãng cho vào đĩa petri có mơi trƣờng TSA ho c HI agar đã chu n bị trƣớc, d ng que trang trang đều đến khi khô.
Tiến hành đục lỗ trên đĩa petri, sau đó d ng micropipet hút 100 ml mật ong bạc hà cho vào lỗ thạch. Đem ủ ở 370C trong 24 giờ và đ c kết quả.
2.5.5.4 Đọc và tính tốn kết quả.
Quan sát và đo lấy kh ch thƣớc của vòng tròn kháng khu n quanh lỗ thạch trên đĩa petri
2.5.6 ương pháp xử lý thống kê số liệu SAS
40
CHƯ NG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả chỉ tiêu hóa lý của mật ong bạc hà
3.1.1 Kết quả thử cảm quan mật ong b c hà theo TCVN 5267:1990
Mật ong đƣ c chia thành nhiều loại khác nhau dựa trên loại hoa mà ong lấy
mật. Khi xét tới chỉ số cảm quan của mật, tiến hành đánh giá các chỉ tiêu bao gồm: Màu sắc, m i, vị, trạng thái (Theo TCVN 5662:1990 và TCVN 5267:1990). Kết quả đánh giá cảm quan của mật ong bạc hà đƣ c trình bày ở Bảng 2.5.
Bảng 3.1. Kết quả thử cảm quan mật ong bạc hà
BH01 BH02 TCVN 5267:1990
Màu sắc Vàng chanh Vàng chanh, s m màu
Vàng chanh
Mùi vị Vị ng t thanh Vị ng t gắt Rất đ c trƣng của hoa bạc hà, khé Trạng thái Sánh sệt Sánh sệt Lỏng-sánh, trong ho c kết tinh dạng m Thang đo pfund (mm) 75 Hổ phách cực trong 109 Hổ phách
Từ kết quả phân tích cảm quan cho thấy màu sắc, mùi, vị, trạng thái, của mật ong bạc hà phù h p với tiêu chu n cảm quan của TCVN 5662:1990 và TCVN
5267:1990. Cụ thể nhƣ sau: về màu sắc từ hổ phách đến hổ phách cực trong về
mùi vị đ c trƣng của hoa cây bạc hà, mùi rất đ c trƣng của hoa bạc hà, khé và trạng thái sánh sệt, trong, khơng q dính.
Nhƣ vậy, kết quả khi đánh giá cảm quan mật ong bạc hà với các chỉ tiêu cảm quan nhƣ: Màu sắc, m i, vị, trạng thái thì tất cả các chỉ tiêu này đều đạt chất lƣ ng theo quy định của TCVN 5662:1990 và TCVN 5267:1990
41
Fructose là đƣờng ch nh đƣ c tìm thấy trong mật ong, tiếp theo là glucose
và sucrose. Hƣơng vị ng t ngào của mật ong đƣ c cho là do hàm lƣ ng fructose cao hơn, và fructose ng t hơn glucose ho c sucrose. Do đó việc xác định hàm lƣ ng đƣờng mật ong c ng là một trong các tiêu ch quan tr ng để ch n lựa các sản ph m mật ong tốt cho sức khỏe
Vì vậy mật ong bạc hà sẽ đƣ c tiến hành các thử nghiệm trong chỉ tiêu hóa lý ao gồm xác định hàm lƣ ng đƣờng khử tự do, hàm lƣ ng đƣờng Saccharose và chỉ số Diatase ( Theo TCVN 5267:1990 ). Kết quả của thử nghiệm đƣ c tr nh ày ở ảng 2.7.
Bảng 3.2 Kết quả chỉ tiêu hóa lý của mật ong bạc hà
Chỉ tiêu BH01 BH02 TCVN 5267:1990 Hàm lƣ ng đƣờng khử tự do, % khối lƣ ng 80% 73,33% Không dƣới 70% Hàm lƣ ng đƣờng Saccharose, % khối lƣ ng 6,34% 6,33% Không quá 5% Chỉ số Diatase, đơn vị Gote 35,3 38,3 Không dƣới 7 Từ ảng 2.7, Theo TCVN 5267:1990 hàm lƣ ng đƣờng khử tự do không dƣới 70 % khối lƣ ng,v trong mật ong hàm lƣ ng đƣờng khử tự do chiếm tỷ lệ rất cao và vị ng t của mật đều đến từ vị ng t của các loại đƣờng khử trong mật ong, khi hàm lƣ ng đƣờng khử tự do dƣới 70 % khối lƣ ng th mật ong có thể ị pha lẫn thêm các loại đƣờng khác. Sau khi tiến hành xác định hàm lƣ ng đƣờng khử tự do thu đƣ c hàm lƣ ng đƣờng khử tự do trong mẫu mật ong BH01 có hàm lƣ ng
42
đƣờng khử tự do là 80%. Vậy mẫu mật ong H01 và đạt yêu cầu theo TCVN 5267:1990.
Theo TCVN 5267:1990 hàm lƣ ng saccharose không quá 5% khối lƣ ng. Hàm lƣ ng saccharose thu đƣ c trong mẫu mật BH01 sau khi tiến hành thí nghiệm thu đƣ c là 6,34 % cao hơn so với TCVN 5267:1990, do trong thời gian thu hoạch mật có thể bị ảnh hƣởng của thời tiết và chất lƣ ng mật hoa nên có thể ngƣời ni đã cho ong ăn thêm đƣờng ho c mật khác nên có thể là cho hàm lƣ ng saccharose tăng nhƣng tăng không đáng kể và c ng không ảnh hƣởng đến chất lƣ ng của mật ong. Vậy mẫu mật ong BH01 không đạt yêu cầu theo TCVN 5267:1990.
Từ ảng 2.7, Theo TCVN 5267:1990 hàm lƣ ng đƣờng khử tự do không dƣới 70 % khối lƣ ng. Sau khi tiến hành xác định hàm lƣ ng đƣờng khử tự do thu đƣ c hàm lƣ ng đƣờng khử tự do trong mẫu mật ong BH02 hàm lƣ ng đƣờng khử tự do là 73,33 %. Vậy mẫu mật ong H02 đạt yêu cầu theo TCVN 5267:1990.
Theo TCVN 5267:1990 hàm lƣ ng saccharose không quá 5% khối lƣ ng. Hàm lƣ ng saccharose thu đƣ c trong mẫu mật BH02 sau khi tiến hành thí nghiệm thu đƣ c là 6,33 % cao hơn so với TCVN 5267:1990. Vậy mẫu mật ong BH02 không đạt yêu cầu theo TCVN 5267:1990.
Từ đó kết luận, kết quả đánh giá cho thấy thành phần đƣờng khử tự do trên 70% tuy đƣờng saccharose cao 5 % nhƣng vẫn an toàn cho sức khỏe con ngƣời và chứng tỏ mật ong bạc hà thu đƣ c từ hoa cây bạc hà có thành phần đƣờng tự nhiên cao, tốt cho sức khỏe của ngƣời dùng.
Theo TCVN 5267:1990 chỉ số hoạt lực diastase không dƣới 7 (đơn vi gote). Sau khi tiến hành kiểm tra thí nghiệm, hoạt lực diastase thu đƣ c trong mẫu mật ong BH01 là 35.3 và trong mẫu mật ong BH02 là 38.3. Vậy mẫu mật ong trắng đạt yêu cầu theo TCVN 5267:1990.
Hoạt lực diastase không dƣới 7 (gote) trong mẫu mật BH01 và BH02 chứng tỏ mật bạc hà có enzyme cao giúp q trình xúc tác sự phân hủy của tinh bột thành maltose nhanh, giúp quá trình hấp thu của ngƣời dùng tốt hơn.
43
3.2.1 Kết quả kháng khuẩn c a mật ong b c à đối với nhóm Vibrio spp
Thử nghiệm đối kháng với các chủng vi khu n Vibrio.spp nhƣ Vibrio Parahaemolyticus gây bệnh đƣờng tiêu hóa ở ngƣời, Vibrio Cholerae gây ra bệnh tả, ho c thổ tả, Vibrio Alginolyticus gây ra viêm tai giữa và nhiễm trùng vết thƣơng và Vibrio Harveyi gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính. Kết quả đƣ c thể hiện ở hình 2.14.
Hình 2.4. Biểu đồ đƣờng k nh vòng kháng khu n Vibrio spp của
mật ong ạc hà và Ciprofloxacin (8 µg/ml) V. Parahaemolyticus V.Cholerae V.Alginolytic us V.Harv eyi Ciprofloxacin (8 µg/ml) 11.00 ± 0.00 13.00 ± 0.50 12.23 ± 0.76 12.50 ± 0.50 BH01 10.67 ± 0.43 10.33 ± 0.72 17.83 ± 0.86 15.00± 0.50 BH02 10.50± 0.50 9.83 ± 0.42 10.67 ± 0.35 14.00 ± 0.23 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
V.Parahaemolyticus V.Alginolyticus V.Harveyi V.Cholerae
ĐƯ Ờ NG KÍNH KH ÁN G KH U ẨN (M M ) Vibrio spp BH01 BH02 Ciprofloxacin (8 µg/ml)
44
Dựa vào kết quả kháng Vibrio spp ở hình 2.14 nhận thấy rằng cả hai mẫu mật ong BH01 và BH02 thể hiện hoạt t nh kháng đối với 4/4 chủng Vibrio spp khảo sát.
Từ hình 2.14 cho thấy trong đó khả năng tạo ra vòng kháng khu n của mẫu H01 với vi khu n Vibrio Alginolyticus cao vƣ t trội hơn hẳn mẫu kháng sinh Ciprofloxacin (8 µg/ml) m c dù vịng kháng khu n của mẫu H02 thấp hơn so cả 2 với vòng kháng khu n lần lƣ c là 17.83 mm, 11.33 mm và 10.67 mm
Còn ở các chủng Vibrio khác nhƣ vi khu n Vibrio Parahaemolyticus thì khả
năng tạo ra vòng kháng khu n ở hai mẫu H01 và H02 gần nhƣ tƣơng đƣơng nhau với các vòng kháng khu n lần lƣ c là 10.67 mm và 10.50 mm nhƣng vẫn con hạn chế so với khả năng tạo ra vòng kháng khu n của kháng sinh Ciprofloxacin (8 µg/ml) với vịng kháng là 16.23 mm. Ở vi khu n Vibrio Cholerae th khả năng tạo ra vòng kháng khu n của mẫu H02 thấp hơn so với mẫu H01 và kháng sinh Ciprofloxacin với các vịng vơ khu n lần lƣ c là 9.83 mm, 10.33 mm và 13.00 mm. Cịn Vibrio Harveyi thì kháng sinh Ciprofloxacin ta ra vòng kháng khu n là 12.50 mm cao hơn hẳn so với mẫu mật ong BH02 có vịng kháng khu n là 14.00 mm và vẫn cao hơn so với mẫu mật ong BH01 có vịng kháng là 15.50 mm.
3.1.2 Kết quả kháng khuẩn c a mật b c à đối với nhóm Salmonella spp
Thử nghiệm đối kháng với các chủng vi khu n Salmonella spp g y ệnh điển h nh nhƣ: Salmonella Typhi g y ệnh thƣơng hàn, Salmonella Typhimurium,
45
Hình 2.5. Biểu đồ đƣờng k nh vịng kháng khu n Salmonella
spp của mật ong ạc hà và Ciprofloxacin (500 µg/ml) S. Typhi S. Typhimurium S. Dudlin S.
Enteritidis Ciprofloxacin (500 µg/ml) 12.00 ± 0.50 11.00 ± 0.00 12.23 ± 0.76 13.00± 0.50 BH01 13.00 ± 0.43 10.50 ± 0.72 NA 10.50± 0.50 BH02 NA 11.17 ± 0.42 NA NA
Dựa vào kết quả kháng Salmonella spp ở hình 2.15 nhận thấy rằng cả mẫu
mật ong BH01 thể hiện hoạt t nh kháng đối với 3/4 chủng và BH02 1/4 chủng
Salmonella spp khảo sát.
Từ hình 2.15 cho thấy khả năng tạo ra vòng kháng khu n của mẫu H02 với