CHƯƠNG 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN CỨU
2.2. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Bốn mẫu DNA virus được cung cấp bởi Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh Quảng Ninh. Các mẫu được tách chiết từ huyết tương bệnh nhân viêm gan B và định lượng bằng bộ kit thương mại GeneProof.
2.2.2. Hóa chất và sinh phẩm
2.2.2.1. Sinh phẩm
o Vector pTZ57R/T (Thermo Fisher Scientific);
o Chủng tế bào khả biến Escherichia coli DH5α (Thermo Fisher Scientific);
o Bộ sinh phẩm Real-time PCR định lượng HBV (GeneProof).
2.2.2.2. Hóa chất
o GoTaq Green Master Mix (Promega);
o GoTaq Probe qPCR Master Mix (Promega);
o Agarose Nusieve 3:1 (Takara);
o Acrylamide: Bisacrylamide (Takara);
o Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Luria Bertani (LB) lỏng gồm 1% trypton; 0.5% cao nấm men; 0.5% NaCl. Bổ sung thêm 1.2% agar đối với LB đặc;
o Kit tinh sạch: GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific);
o Kit nhân dòng gen: InsTAclone™ PCR Cloning Kit (Fermentas);
o Kit tách plasmid: PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen);
o Đệm điện di TBE 1X với thành phần chứa trong 100ml như sau: 1.08 g Tris- base, 0.55 g acid boric, 400 µl EDTA 0.5 M pH 8;
o Các cặp mồi và đầu dò thiết kế với trình tự được trình bày trong Bảng 2.1 và Bảng 2.2;
o Các hóa chất thơng dụng khác đảm bảo độ tinh sạch dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử.
Bảng 2.1: Trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự mồi (5’ - 3’) Băng khuếch đại Mục đích
HBV-F1 GCGTGCACATGTGGGTG 105 bp Khuếch đại gen P HBV HBV-R1 ACAGCGCACTAGAAGCAG HBV-F1-C ATGACTGCGAGTCGGCCG 107 bp Thiết kế IC HBV-R1-C GCCACGCAAAGAACTGGCA Lamda-F1-NcoI ATACCATGGATCGTAACAC ACGCAGAGACT 183 bp Lamda-R1-NcoI ATACCATGGGAACATCAGC GACGAGTAAGA HBV-F1/R-NcoI CATGGAGCACGCTCATCCA CCG 218 bp HBV-R1/R-NcoI CATGGGCTTAGCTGTCTCTC TGG M13 F GTAAAACGACGGCCAGT 260 bp và 373 bp Sàng lọc khuẩn lạc M13 R CGAGAAACAGCTATGAC
Bảng 2.2: Trình tự các đầu dị Taqman được sử dụng trong nghiên cứu
Đầu dị Taqman Trình tự đầu dị Taqman (5’ - 3’)
Đầu dò Taqman HBV FAM – CATAGATCCCCTTGCCCTCCTGG – BHQ2
Đầu do Taqman IC Cy5 – GACTCATCTCTCACACTGACACGAG – BHQ2
2.2.3. Trang thiết bị
Đề tài sử dụng các máy móc, trang thiết bị phục vụ cho đề tài nghiên cứu thuộc Phịng thí nghiệm Sinh Y và Phịng Sinh học phân tử - Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống - Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.