Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Tạo DNA nội chuẩn
Để đánh giá được quá trình tách chiết DNA cũng như q trình khuếch đại sản phẩm, chúng tơi thiết kế một đoạn DNA nội chuẩn (Internal control, IC). Đoạn IC có những đặc điểm sau: kích thước tương tự genome của HBV, có vị trí bám của cặp mồi khuếch đại gen P của HBV, có lõi là DNA genome của thực khuẩn thể λ và khơng có trình tự tương đồng với genome người hay genome virus. Do đó khi IC được thả vào mẫu huyết thanh và được tách chiết cùng với DNA HBV, giúp xác định được hiệu suất tách chiết, sự có mặt của chất ức chế, từ đó ngăn ngừa hiện tượng âm tính giả. Trong real-time PCR, IC cùng được khuếch đại với gen đích (gen P) bằng chính cặp mồi của gen đích, do đó khơng chỉ đánh giá được hiệu suất của quá trình tách chiết mà còn đánh giá được hiệu quả của việc gắn mồi.
3.3.1. Thiết kế đoạn IC
Dựa trên trình tự DNA genome của thực khuẩn thể λ, chúng tơi chọn một trình tự 171 bp (pre-IC) với tỉ lệ GC tương tự như đoạn gen P. Bằng công cụ BLAST (NCBI) chúng tơi đã xác định trình tự này hồn tồn khơng tương đồng với trình tự DNA genome của HBV và DNA genome người, đồng thời có kích thước khác với đoạn gen P của HBV thích hợp cho việc sử dụng làm IC. Đoạn gen của thực khuẩn thể được khuếch đại với cặp mồi mang thêm trình tự nhận biết của cặp mồi HBVF1/R1. Kết quả điện di trên Hình 3.6 cho thấy chúng tôi đã khuếch đại thành cơng đoạn IC có kích thước 220 bp.
Hình 3.6: Sản phẩm IC khuếch đại từ DNA thực khuẩn thể. M: marker DNA 100 bp;
(-): đối chứng âm khơng có khn.
3.3.2. Tách dịng IC
Để thuận lợi cho việc sử dụng và lưu giữ IC, chúng tơi tiến hành tách dịng sản phẩm IC trong vector pTZ57R/T. Sản phẩm tách dòng được biến nạp trong vi khuẩn
E.coli. Kiểm tra các khuẩn lạc thu được bằng cặp mồi M13 của vector và cặp mồi đặc
hiệu của HBV, chúng tơi thu được một dịng chứa plasmid pTZ57R/T mang đoạn IC (Hình 3.7).
Hình 3.7: Kết quả sàng lọc khuẩn lạc (1-4) mang đoạn chèn IC 218 bp trên gel
agarose 2%. A: Sàng lọc bằng mồi HBV F1/R1. B: Sàng lọc bằng mồi M13 F/R. M: Marker 100 bp; (-): Đối chứng âm không chứa khuẩn lạc.
Kết quả điện di trên Hình 3.7 cho thấy cả 4 khuẩn lạc đều mang đoạn chèn có kích thước mong muốn. Chúng tơi chọn khuẩn lạc 4 để ni bão hịa và tách plasmid theo “PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit”. Để kiểm tra kết quả tách chiết, plasmid mang đoạn chèn IC được đo nồng độ bằng máy Nanodrop và điện di kiểm tra trên gel agarose (Hình 3.8).
Hình 3.8: Kết quả xác định nồng độ và điện di kiểm tra plasmid IC. A: Kết quả xác
định nồng độ plasmid IC. B: Kết quả điện di 100 ng plasmid IC (giếng IC) trên gel
agarose 1%. M: Marker SY 4.6 kb.
Hình 3.8 B cho thấy băng plasmid dạng siêu xoắn rất đậm chứng tỏ quá trình tách chiết tốt ít xảy ra đứt gãy. Đồng thời kết quả xác định nồng độ Hình 3.8 A cho thấy plasmid IC có nồng độ cao và độ sạch ở mức cho phép.
Để khẳng định kết quả tách dịng, chúng tơi tiến hành giải trình tự plasmid. Sử dụng kết quả giải trình tự so sánh với các trình tự đã cơng bố của NCBI cho trình tự đoạn chèn trong plasmid IC hoàn toàn tương đồng với genome thực khuẩn thể lambda. Điều này chứng tỏ cặp mồi chúng tôi thiết kế đã khuếch đại thành cơng trình
tự đích mong muốn và tách dịng thành cơng plasmid. Chúng tơi kí hiệu plasmid này là pIC.
Hình 3.9: Kết quả so sánh trình tự đoạn chèn IC với trình tự trên NCBI.