Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách dòng plasmid mang đoạn gen P của HBV
Các mẫu đã được xác định có HBV bằng bộ kit chẩn đoán HBV của GeneProof (do Trung tâm Y tế dự phòng Quảng Ninh cung cấp) được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi HBV F1/R1 để khuếch đại vùng gen P của HBV theo thành phần và điều kiện trình bày ở Bảng 2.3. Kết quả điện di trên Hình 3.1 cho thấy PCR khuếch đại thành cơng đoạn DNA kích thước khoảng 105 bp, đúng với kích thước mong muốn.
Hình 3.1: Kết quả khuếch đại gen P từ 2 mẫu dương tính HBV (1, 2) bằng cặp mồi
HBV F/R. M: Marker DNA 100 bp; (-): Đối chứng âm không DNA khuôn.
Sản phẩm khuếch đại từ mẫu 2 (Hình 3.1) được đưa vào vector tách dòng pTZ57 R/T để tạo plasmid tái tổ hợp và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
Khuẩn lạc được sàng lọc trên môi trường có bổ sung ampicilin nồng độ 50 μg/ml. Chúng tôi chọn 4 khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch sử dụng trực tiếp làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi của vector M13 F/R và cặp mồi của đoạn chèn HBV F1/R1. Kết quả trình bày trên Hình 3.2 cho thấy cả 4 khuẩn lạc đều mang đoạn chèn có kích thước mong muốn.
Hình 3.2: Kết quả sàng lọc khuẩn lạc (1-4) mang đoạn chèn HBV 105 bp trên gel
agarose 2%. A: Sàng lọc bằng mồi HBV F1/R1. B: Sàng lọc bằng mồi M13 F/R. M: Marker DNA 100bp; (-): Đối chứng âm không chứa khuẩn lạc.
Chúng tôi chọn khuẩn lạc 3 để ni bão hịa và tách plasmid HBV theo “PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit”. Để kiểm tra kết quả tách chiết, plasmid được xác định nồng độ bằng máy nanodrop và điện di kiểm tra (Hình 3.3). Chúng tơi kí hiệu plasmid mang đoạn gen P của HBV là plasmid HBV (pHBV).
Hình 3.3: Kết quả xác định nồng độ và điện di kiểm tra plasmid HBV. A: Kết quả
xác định nồng độ plasmid HBV. B: Kết quả điện di 100 ng plasmid HBV (giếng P) trên gel agarose 1%. M: Marker SY 4.6 kb.
Trên ảnh điện di, pHBV xuất hiện ba băng tương ứng với ba dạng cấu hình khác nhau. Trong đó, băng thấp nhất khoảng 2 kb tương ứng với dạng siêu xoắn đậm nhất, chứng tỏ plasmid ít bị đứt gẫy trong quá trình tách chiết. Đồng thời, kết quả đo nanodrop cho thấy pHBV có nồng độ cao và độ sạch ở mức cho phép, có thể sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Để khẳng định kết quả tách dịng, chúng tơi tiến hành giải trình tự pHBV. Sử dụng phần mềm Bioedit, chúng tôi so sánh đoạn chèn của pHBV với 8 trình tự genotype của HBV đã công bố trên NCBI (National Center for Biotechnology Information) có mã số lần lượt là: AP007263.1, AB981583.1, AB981580.1, AB554024.1, AP007261.1, HE974366.1, AP007264.1 và AB298362.1. Kết quả thu được ở Hình 3.4 cho thấy chúng tơi đã tách dịng thành cơng một đoạn DNA từ vị trí nucleotide 1201 đến 1305 tương ứng với của gen P của HBV và trình tự này có sự tương đồng với 8 genotype của HBV. Điều này chứng tỏ cặp mồi chúng tôi thiết kế đã khuếch đại thành cơng trình tự đích mong muốn và tách dịng thành cơng pHBV.
Hình 3.4: Kết quả so sánh trình tự đoạn chèn của plasmid HBV với 8 trình tự
genotype. Hình ảnh trích xuất từ kết quả phân tích của phần mềm Bioedit v7.2.