2.2.1.Sử dụng các phần mềm ứng dụng trong sinh học
*Sử dụng phần mềm Mega để ƣớc tính sự sai khác dựa vào khoảng cách các trình tự ADN của các lồi
Tất cả các trình tự sau khi tải từ ngân hàng gen (Genbank) về sẽ đƣợc sắp xếp ở dạng matrix bằng cách sử dụng phần mềm Paup 4.0 beta 10 win. Trƣớc khi đƣợc sắp xếp thành dạng ma trận chúng sẽ đƣợc sắp xếp đúng thứ tự trong phần mềm Bioedit để có độ dài đoạn gen bằng nhau. Sau khi đƣa dữ liệu trình tự vào phần mềm Mega5.05 các trình tự sẽ đƣợc cắt tỉa ở vị trí có chiều dài 650 nucleotit. Thành phần trình tự và mơ hình thay thế cho toàn bộ bộ dữ liệu, số lƣợng của nucleotit và các vị trí amino axit có thể thay đổi và sự sai lệch của cặp trình tự 2 thơng số Kimura (K2P) trong phạm vi nhóm ở nhiều mức độ phân loại (trong cùng loài, giữa các loài cùng chi và giữa các loài ở các chi khác nhau trong cùng một họ)
đã đƣợc tính tốn trong Mega5.05. Mơ hình thay thế K2P chứ khơng phải là một mơ hình thực tế hơn đã đƣợc sử dụng để tính tốn khoảng cách mà cho phép lặp lại các phân tích qua BOLD (Barcode of life data system) và sự so sánh với các nghiên cứu mã vạch dựa vào khoảng cách kinh điển. Sự phân bố của cặp K2P ở từng mức độ phân loại đƣợc hình dung bằng cách sử dụng đồ thị mật độ R. Sự tƣơng quan sản phẩm- thời điểm Peason và sự tƣơng quan hạng Spearman giữa kích thƣớc mẫu và khoảng cách trung bình trong lồi cũng đƣợc tính tốn trong R để xác định liệu số lƣợng mẫu sẵn có có tác động đến khoảng cách trong chủng loại hay khơng. Các lồi đƣợc sắp xếp vào một trong bốn loại sau dựa vào khoảng cách cặp K2P: loại I (khoảng cách trong loài lớn nhất <2%, khoảng cách giữa các loài bé nhất <2%); loại II (khoảng cách trong loài lớn nhất = 2%, khoảng cách giữa các chủng loại bé nhất <2%); loại III (khoảng cách trong loài lớn nhất <2% và khoảng cách giữa các loài bé nhất £2%); loại IV (khoảng cách trong loài lớn nhất = 2% và khoảng cách giữa các loài bé nhất £2%). Ở những lồi mà chỉ có một cá thể đƣợc lấy mẫu thì các loại I, II, III và IV đƣợc bỏ qua vì chỉ có khoảng cách giữa các loài khác nhau đƣợc ƣớc lƣợng. [16]
*Sử dụng phần mềm Mega để ƣớc tính sự sai khác dựa vào đặc điểm các trình tự ADN của các loài
Những đặc điểm nhận dạng độc đáo duy nhất, đƣợc phân biệt ở đây nhƣ trạng thái nucleotit đơn mà phân biệt một loài với một loài khác trong họ của nó, đƣợc xác định cho mỗi họ bằng cách sử dụng Hệ thống tổ chức thuộc tính đặc trƣng (CAOS - Characteristic Attribute Organization System- Sarkar et al. 2002, 2008; Bergmann et al. 2009). Khi tất cả các thành viên của loài chia sẻ các đặc điểm này, chúng đƣợc gọi là “các đặc tính độc đáo đơn giản’’. Một cây hƣớng dẫn lần đầu tiên đƣợc tạo ra bằng cách sử dụng module tiết kiệm tối đa của Phylip (v3.67; Felsenstein 1989) và đƣợc sửa đổi thành mẫu nhóm cá thể theo các chỉ định loài hiện hành. Cây hƣớng dẫn này sau đó đƣợc chuyển vào một file Nexus cái mà chứa các trình tự ADN COI hay Cyt b và kịch bản p-genome đƣợc sử dụng để nhận dạng
các đặc điểm. Tỷ lệ của tất cả các loài trong mà thể hiện các đặc tính trong phạm vi họ cũng nhƣ là tỷ lệ trong mỗi họ đã đƣợc tính tốn. Cuối cùng số lồi thể hiện các đặc tính trong phạm vi họ cho mỗi loại mà đƣợc nhận dạng dựa vào khoảng cách cũng đã đƣợc tính tốn.[16]
* Phƣơng pháp xây dựng cây phát sinh loài
Hai cây phát sinh loài theo phƣơng pháp p- distance đƣợc xây dựng cho tất cả các trình tự gen Cyt b và COI trong Mega5 để có thể hình dung đƣợc nguồn gốc phát sinh của các lồi cũng nhƣ kiểm tra đƣợc liệu có lồi nào bị xác định nhầm kiểu gen hay không.
2.2.2.Phƣơng pháp đánh giá mức độ hiệu quả trong nhận dạng loài dựa vào khoảng cách
Bằng cách thống kê các số liệu và tính tốn tỷ lệ % thơng thƣờng để đƣa ra những kết quả cần thiết và đánh giá kết quả đó thơng qua sự so sánh.
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN