1.3.3.1. Sự cần thiết của công nghệ loại bỏ ADN người trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn huyết
Để giảm thiểu ảnh hưởng của các yếu tố bất lợi quá trình PCR đa mồi cần phải được cân nhắc từ khâu thiết kế mồi, quy trình tách và làm sạch ADN bệnh phẩm cho đến việc thay đổi các thành phần phụ gia cho phản ứng. Một khó khăn nữa trong việc triển khai kỹ thuật PCR vào chẩn đoán tác nhân vi sinh vật gây NKH đó là lượng ADN người có trong mẫu bệnh phẩm máu: thông thường một bệnh nhân
NKH (nhiễm E. coli) sẽ có những biểu hiện lâm sàng đầu tiên khi mật độ vi khuẩn
trong máu ở mức 100-1000CFU/ml [2], [25]. Trong khi đó một phản ứng PCR sử dụng ADN thu nhận từ Kit tách Qiagen, chỉ có thể phát hiện được ribosomal 16S DNA vi khuẩn nếu mật độ của chúng vượt quá ngưỡng 500 CFU/ml. Vì thế với
trường hợp bệnh nhân nhiễm khuẩn nhập viện có mật độ vi khuẩn trong máu quá thấp dưới ngưỡng phát hiện, khi đó phương pháp này sẽ không thể phát hiện được, gây nên hiện tượng âm tính giả. Ở một khía cạnh khác, các giả thuyết gần đây cho rằng sự tiến hố hình thành tế bào nhân chuẩn (bao gồm cả tế bào người) là kết quả
của sự lai ghép giữa nhóm archaeal với proteobacterial hoặc cyanobacterial
prokaryote, điều này có nghĩa sẽ tồn tại các trình tự tương đồng có tính bảo tồn cao
giữa các nhóm tế bào vi khuẩn, nấm men và tế bào động vật có vú bao gồm cả tế bào người [16], [29], [33], [38]. Vì thế nếu phản ứng PCR sử dụng các chuỗi mồi có trình tự bắt cặp và khuếch đại các khu vực bảo tồn cao (thuật ngữ tiếng Anh là highly conserved motif), hiện tượng dương tính giả sẽ xuất hiện. Để hạn chế các hiện tượng âm tính giả do độ nhạy kỹ thuật thấp và dương tính giả do bắt cặp của mồi vào khu vực bảo tồn giữa các lồi, người ta có thể sử dụng các Kit loại bỏ ADN người kết hợp làm giàu ADN vi khuẩn sau đó mới thực hiện các phản ứng PCR đặc hiệu [16].
Thông thường một Kit loại bỏ ADN người thường bao gồm các thành phần i) giúp phá vỡ tế bào máu tổng số đồng thời gây đứt gãy ADN người, thông thường các hố chất này sẽ khơng làm tổn thương tế bào vi khuẩn ii) thu nhận và tách đặc hiệu ADN vi khuẩn. Hiện nay Kít làm giàu ADN vi khuẩn do hãng MolYsis, có thể cho hiệu quả làm giàu 40000 lần nhưng giá thành rất cao (khoảng £10/lần tách) [31] vì thế rất khó được chấp nhận ở những nước thu nhập thấp trong đó có Việt Nam. Để khắc phục những khó khăn trên, chúng tơi thiết lập phương pháp loại bỏ ADN người kết hợp làm giàu ADN vi khuẩn: Ý tưởng kỹ thuật này là một điểm mới chưa từng được triển khai tại bất cứ phịng thí nghiệm hay trung tâm chẩn đoán nào ở nước ta. Các bệnh phẩm máu ngoại vi hoặc các dịch cơ thể có nghi ngờ mang vi khuẩn được rửa bằng dịch phá bạch cầu Mammalian cellular lysis (MCLB1) [14], [31], nhờ đó loại bỏ các thành phần ức chế phản ứng PCR như heparin, huyết sắc tố.
1.3.3.2. Cơ sở lý thuyết của công nghệ loại bỏ ADN người ”làm giàu” ADN vi khuẩn khuẩn
Mục đích: tạo ra một loại dung mơi có khả năng phá bỏ tế bào người nhưng bảo tồn được tế bào vi khuẩn trong một thời gian nhất định.
Cơ sở lý thuyết: Màng tế bào người và màng tế bào vi khuẩn có sự khác nhau về thành phần cấu tạo: Màng tế bào người yếu ớt, chủ yếu là lipid vì thế dễ bị phá hủy bởi dung môi kỵ nước hoặc dung môi phân cực (SDS, Triton X, NP40 chaps… Mặt khác các sợi nhiễm sắc thể là các đại phân tử dễ bị đứt gãy trong các điều kiện kiềm tính cao, pH cao. Trong khi đó, đối với vi khuẩn, màng tế bào được cấu tạo chủ yếu là peptidoglycan, cũng có lipid nhưng thành phần khơng chiếm ưu thế, đặc biệt có glycan (gluxit), giúp vi khuẩn chống chịu được các điều kiện hóa chất nghiệt ngã (pH, chất tẩy rửa). Chính vì thế, chúng tơi sử dụng các chất tẩy rửa và các chất phân cực như SDS, Triton X-100, NP4, Chaps…và sử dụng các buffer có bước nhảy pH kiềm tính [14], [31]. Sau khi thử nghiệm thu được dung mơi cần tìm, dung mơi này sẽ loại bỏ được ADN người trong khoảng thời gian nhất định, chúng tôi sử dụng dung dịch axit yếu để trung hịa, khi đó pH trở về pH trung tính. Ở pH này tế bào vi khuẩn sẽ khơng bị ảnh hưởng. Q trình ly tâm tiếp theo sẽ thu được tế bào vi khuẩn lắng cặn ở dưới, phần phía trên là các nhiễm sắc thể của tế bào người bị đứt gãy sẽ được loại bỏ. Quá trình tách chiết ADN vi khuẩn sẽ được tiến hành theo quy trình tách chiết thơng thường hoặc sử dụng các kit tách chiết ADN thương mại.
Hiệu quả loại bỏ ADN người sẽ được đánh giá bằng việc định lượng nồng độ gen betaglobin có trong mẫu tách chiết có xử lý và không qua xử lý loại bỏ ADN người và có so sánh giữa dung môi tự chế với kit loại bỏ ADN người Molysis.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU