3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI PHÁT
3.1.6.1. nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu chứng âm và chuẩn dương
Bảng 7. Kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu bộ mồi Ent/beta và EPKS thiết kế trên
các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriacae và ADN khác (Phụ lục 1 kèm
theo)
STT Lồi vi khuẩn hoặc nhóm Số mẫu Kết quả PCR Độ đặc
hiệu PCR (%) PCR (+) Ent/beta PCR(+) EPKS 1 Escherichia coli 34 34 34 2 Klebsiella pneumoniae 20 20 20 3 Salmonella sp 2 2 2 4 Proteus sp 1 1 1 5 Enterobacteriaceae sp 3 3 0 100 6 Staphylococcus aureus 1 0 0 100 7 Streptococcus pneumoniae 1 0 0 100 8 Pseudomonas aeruginosa 1 0 0 100 9 Acinetobacter baumanii 1 0 0 100 10 Candida albicans 1 0 0 100 11 Aspergillus sp 1 0 0 100 12 Fusarium sp 1 0 0 100
13 Virut viêm gan B (HBV) 2 0 0 100
14 Virut Epstain – Barr 2 0 0 100
15 Virut Herpes simplex 2 0 0 100
16 ADN người 1 0 0 100
Áp dụng cơng thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu như đã trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu, ta có:
Với bộ mồi Ent/beta: Se = (a/a+c) x 100 (%) =(60/60)x100=100% Sp = (d/b+d) x 100 (%)=(14/14)x100=100% Với bộ mồi EPKS: Se=(57/57)x100=100%
Sp=(17/17)x100 =100% Đánh giá độ đặc hiệu của PCR đa mồi
Thí nghiệm sử dụng các mẫu ADN được tách chiết từ các loài vi khuẩn gây
bệnh khác như: Staphylococcus aureus; Streptococcus pneumoniae; Pseudomonas
aeruginosa; Acinetobacter baumanii, ADN người, ADN nấm, ADN virut khác. Kết
quả thể hiện qua bảng và hình ảnh điện di sau (Phụ lục 1 kèm theo):
Hình 14. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của bộ mồi trên ADN tác nhân gây bệnh khác
Ghi chú: M50 - maker 50 bp;
1- Chứng âm; 2- Pseudomonas aeruginosa; 3- Staphylococcus aureus; 4- Streptococcus pneumoniae; 5- Acinetobacter baumanii; 6- Nấm Cadida albicans; 7- Nấm Aspergillus sp; 8- Nấm Fusarium sp; 9-10: ADN virut viêm gan B; 11-12: ADN virut Epstain – Barr; 14-15: ADN virut Herpes simplex; 16: ADN máu người khỏe mạnh; 17: Chuẩn dương
Qua hình ảnh điện di cho thấy khơng có kết quả dương tính giả nào được ghi nhận trên các bệnh phẩm thử nghiệm. Kết quả cho thấy các bộ mồi chúng tơi thiết
kế có độ đặc hiệu cao, khơng nhầm lẫn với các mầm bệnh khác cũng như ADN của bộ gen người. Thực tế sau khi tiến hành đánh giá ngưỡng phát hiện và tính đặc hiệu của phương pháp chúng tôi lấy ngưỡng phát hiện là 10 CFU/ml. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương tự như nghiên cứu khác với độ nhạy kỹ thuật dao động trong khoảng 10-50 CFU/ml, nghiên cứu của Hossein Fazzeli và cs cũng có kết quả tương tự khi thấy PCR có độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 100%, với ngưỡng phát hiện là10 copies/1 phản ứng [20].
3.1.6.2. Kết quả khảo sát ngưỡng phát hiện vi khuẩn của phương pháp trên thực hành
Để xác định ngưỡng phát hiện của phương pháp chúng tôi tiến hành pha các mầm bệnh thành các dải nồng độ khác nhau từ 104 CFU/ml đến 100 CFU/ml. Sau đó chúng tơi tiến hành tách chiết ADN tổng số của các vi khuẩn và chạy PCR đa mồi trên các ADN chuẩn dương đơn. Kết quả như sau:
Hình 15. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của PCR đa mồi trên các mẫu chuẩn dương
Nhận xét: qua hình ảnh điện di ở trên cho thấy: ngưỡng phát hiện là 1-10 CFU/ml, tuy nhiên để giảm thiểu yếu tố ngoại nhiễm chúng tôi lấy ngưỡng phát hiện cao hơn là 10 CFU/ml.
Như vậy, qua khảo sát bước đầu cho thấy kỹ thuật PCR đa mồi mà chúng tơi thiết kế có thể phát hiện nồng độ vi khuẩn 10 CFU/ml mẫu. Tuy nhiên, đây cũng mới chỉ là kết quả bước đầu thử nghiệm nên kết quả chỉ có giá trị tham khảo. Để xác định được giá trị ngưỡng phát hiện cần phải có nhiều lần thử nghiệm và đánh giá mức độ phân tán và những sai số gặp phải.
3.2. THIẾT LẬP CÔNG NGHỆ LOẠI BỎ ADN NGƯỜI KẾT HỢP ‘’LÀM GIÀU’’ ADN VI KHUẨN
Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh vẫn ln được quan tâm. Vì ưu điểm của phương pháp này là nhanh, độ nhạy cao. Tuy nhiên, việc tiến hành trên mẫu bệnh phẩm lại gặp những khó khăn bởi tính chất phức tạp của các loại bệnh phẩm, đặc biệt đối với bệnh phẩm máu với các chất ức chế vốn có trong máu ngoại vi (hemoglobin), nồng độ ADN vi khuẩn trong máu không đáng kể so với ADN người. Đối với phản ứng PCR đa mồi nếu có quá nhiều mồi chúng sẽ triệt tiêu lẫn nhau làm giảm độ nhạy kỹ thuật của phản ứng. Do tính chất bảo tồn tiến hố giữa các lồi, một tỷ lệ nhất định các vật chất di truyền của vi khuẩn sẽ được bảo tồn và có trình tự gần giống một phần bộ gen của sinh vật bậc cao (trong đó có con người) vì thế nếu đoạn mồi được thiết kề hướng vào các khu vực bảo tồn này, hiện tượng bắt chéo của mồi vào ADN gen người sẽ diễn ra gây nên dương tính giả. Để giảm thiểu các nguy cơ nói trên, việc tách và loại bỏ ADN người trước khi thực hiện phản ứng PCR là cần thiết, vì thế đề tài đặt ra nội dung quan trọng là thiết lập quy trình loại ADN người và làm giàu ADN vi khuẩn. Chúng tôi đã đạt được một số kết quả sau:
3.2.1. So sánh hiệu suất tách và chất lượng ADN cũng như khả năng loại bỏ ADN người bằng các dung môi khác nhau
Để thiết lập được phương pháp loại bỏ ADN người, chúng tôi tiến hành pha
bệnh phẩm giả định (1ml máu ngoại vi người khoẻ mạnh có chứa 10e7CFU E. coli).
Kết quả đánh giá hiệu quả loại bỏ ADN người của các công thức dung môi được thể hiện qua các thông số về nồng độ ADN thu nhận được và độ sạch của ADN. Cụ thể qua bảng sau:
Bảng8: Hàm lượng và chất lượng ADN thu nhận từ 1ml máu ngoại vi chứa vi
khuẩn E.coli
Công thức dung môi Na2CO3 Triton-X
100 (%) NaCl NH4Cl NaHCO3 EDTA SDS NP40 pH
Nồng độ DNA ug/ul A260/A280 MCLB1 1000mM 1 0mM 0 0 5mM 0 0 9.8 5 1.3 MCLB2 1000mM 1 0mM 0 0 5mM 0 0 9.5 5.9 2.7 MCLB3 1000mM 1 10mM 0 0 5mM 0 0 8.5 420 1.9 MCLB4 1000mM 1 10mM 0 0 0 0 0 8 435 1.9 MCLB5 1000mM 2 10mM 0 0 0 0 0 7.5 425 1.8
Nhận xét: thành phần dung môi ảnh hưởng rất đáng kể tới hàm lượng ADN thu nhận từ máu ngoại vi, nó cịn ảnh hưởng cả tới độ tinh khiết của các mẫu ADN có nồng độ thấp (dưới 5ug/l) và khơng ảnh hưởng q nhiều tới các mẫu ADN có nồng độ lớn hơn. Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm và lựa chọn dung môi tối ưu nhất là MCLB1 dùng trong thực hành. Chúng tôi đặt tên sinh phẩm MCLB1 này là SHPT108@dehumanDNA.