Kết quả sau khi đo cho thấy sau khi chưng cất, các peak sắc ký của PAEs đều hạ thấp đáng kể, chứng tỏ việc este hóa n - hexan có hiệu quả, đã loại bỏ hầu hết
PAEs có trong dung mơi. Vậy khi đó dung mơi đủ độ tinh khiết để thực hiện các phép phân tích phthalates tiếp theo.
2.4.5. Quy trình khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn
Pha dung dịch chuẩn gốc: chuyển 1,0 mL dung dịch chuẩn gốc mix 10 PAEs nồng độ 1000,0 mg/L (ppm) vào bình định mức 100,0 mL, định mức đến vạch bằng dung môi n - hexan được dung dịch chuẩn 10 PAEs 10,0 mg/L (ppm). Bảo quản dung dịch trong bình định mức, bọc kín bằng giấy bạc và lưu trữ trong tủ lạnh âm sâu.
Đường chuẩn mix 10 PAEs được xây dựng gồm 7 điểm chuẩn ở các mức nồng độ tăng dần từ 0,1 - 100,0 g/L (ppb), được pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc bằng dung môi n - hexan đã tinh chế.
2.4.6. Tối ưu hóa phương pháp xử lý mẫu
2.4.6.1. Dung môi chiết
Khảo sát các loại dung môi chiết PAEs từ nền mẫu dầu ăn đã được trình bày trong nhiều nghiên cứu. Kĩ thuật chiết lỏng lỏng mang lại khả năng phân tích cao khi lựa chọn được dung môi chiết phù hợp. Dung môi được lựa chọn cho phương pháp cần đáp ứng các điều kiện: có khả năng hịa tan tốt chất phân tích, có ái lực mạnh với chất cần phân tích, hạn chế đồng chiết nền mẫu, dung môi chiết và nền mẫu có khả năng tách hồn tồn nhau. Theo tác giả Long Kai Shi (2016) [27], trong 4 dung môi thường dùng để chiết PAEs là n - hexan, diclometan, acetonitril và metanol thì n - hexan là
dung môi chiết tối ưu nhất cho DMP, DEP, DBP và BBP. Đối với phân tử PAEs có khối lượng phân tử lớn như DEHP thì ACN là dung mơi chiết phù hợp nhất. Tuy nhiên sự khác nhau giữa n - hexan và ACN khi chiết DEHP là không đáng kể. Trên cơ sở đó, trong nội dung nghiên cứu này, chúng tơi cũng sử dụng dung môi n - hexan làm dung môi chiết các PAEs trong nền mẫu dầu ăn.
2.4.6.2. Số lần chiết
Số lần chiết càng nhiều thì lượng PAEs được chiết ra trong dầu ăn càng tăng đến cực đại. Tuy nhiên, chiết nhiều lần làm tăng thể tích dịch chiết dẫn đến thời gian quá trình làm giàu mẫu sẽ kéo dài, dễ bị mất chất trong giai đoạn thổi khô và
cơ quay. Do đó, chúng tơi tham khảo các quy trình xử lý mẫu trong các nghiên cứu khác và lựa chọn số lần chiết là 2.
2.4.6.3. Phương pháp làm giàu mẫu
Hạn chế của kỹ thuật chiết lỏng lỏng là sau khi chiết mẫu, thể tích dung mơi chiết thường rất lớn. Do đó cần thiết phải áp dụng phương pháp làm bay hơi bớt dung môi đồng thời khơng làm mất chất phân tích. Làm giàu mẫu trước khi đưa vào hệ GC - MS/MS thơng thường có 2 phương pháp: cô quay chân không giới hạn nhiệt độ và thổi khô lạnh. Cô quay chân khơng có giới hạn nhiệt độ sẽ làm bay hơi dung môi khá nhanh, tuy nhiên lượng chất phân tích cũng có thể bị mất theo. Cịn phương pháp thổi khô lạnh bằng khí có ưu điểm là lượng chất phân tích ít bị mất trong quá trình thổi khơ, nhưng thời gian thổi khô khá lâu nếu lượng dịch chiết lớn. Việc kết hợp hai phương pháp giúp tiết kiệm thời gian phân tích, hạn chế khả năng làm bay hơi dung môi cũng như hạn chế thời gian tiếp xúc giữa chất phân tích với mơi trường khơng khí xung quanh, từ đó làm tang hiệu suất thu hồi các phthalate khảo sát. Do đó. trong nghiên cứu này, chúng tôi kết hợp cả hai phương pháp trên để tối ưu hóa giai đoạn làm giàu mẫu.
2.6.4.4. Thiết kế thí nghiệm
Phương pháp mặt đáp ứng (Respond Surface Methods - RSM) là một trong những phương pháp dùng để đánh giá tổng quát sự ảnh hưởng của các yếu tố độc lập đến mục tiêu nào đó. Trong nghiên cứu này, chúng tơi thiết kế thí nghiệm bao gồm 3 biến độc lập liên tục (Tỷ lệ thể tích dung mơi/thể tích mẫu,nồng độ dung dịch NaCl và thời gian chiết)được đưa vào hàm mục tiêu ( ) - hiệu suất chiết xuất phtalate trong mẫu(1).Các biến X1, X2, X3 được bố trí thí nghiệm ở năm mức - α, -1, 0, +1 và +α. Số
thí nghiệm cần thực hiện là 20 (23 thí nghiệm tại mức gốc, 6 thí nghiệm tại điểm sao và 6 thí nghiệm lặp lại tâm với một hàm mục tiêu là hiệu suất thu hồi PAEs). Phần mềm MODDE 12.1 được sử dụng để thiết kế ma trận thí nghiệm, tính tốn các giá trị hồi quy và phân tích phương sai.
Bảng 6. Giá trị mã hóa các yếu tố thực nghiệm
- α -1 0 + 1 +α
X1 Vdm/Vmẫu 4,3 5,0 6,0 7,0 7,7
X2 NaCl (%) 6,6 8,0 10,0 12,0 13,4
X3 Thời gian chiết (phút) 1,6 5,0 10,0 15,0 18,4
Thiết kế thí nghiệm với các mức được mã hố trong bảng 7 Bảng 7. Thiết kế thí nghiệm ở các mức
Số thí nghiệm V (dung mơi)/V(mẫu) C% NaCl Thời gian chiết
1 -1 -1 -1 2 1 -1 -1 3 -1 1 -1 4 1 1 -1 5 -1 -1 1 6 1 -1 1 7 -1 1 1 8 1 1 1 9 -α 0 0 10 α 0 0 11 0 - α 0 12 0 α 0 13 0 0 - α 14 0 0 α 15 0 0 0 16 0 0 0 17 0 0 0 18 0 0 0 19 0 0 0 20 0 0 0
Ảnh hưởng của các yếu tố cũng như sự tương tác giữa chúng với hàm mục tiêu (hiệu suất chiết PAEs) được tiến hành xây dựng bởi hàm hồi quy bậc 2 cho hàm mục tiêu như sau:
= β0 + βi∑xi + βii∑x2
i + βi j∑xix j
Trong đó là hàm mục tiêu, β0 là hằng số; βi, βij, và βii lần lượt là hệ số tuyến tính được xác định qua thực nghiệm.
2.4.6.5. Quy trình xử lý mẫu
Chiết PAEs từ nền mẫu dầu thực vật theo phương pháp chiết lỏng lỏng được tham khảo. Sau khi tối ưu các yếu tố: dung môi chiết, tỉ lệ dung môi/mẫu, số lần chiết, thời gian chiết, nồng độ dung dịch NaCl và phương pháp làm giàu mẫu, chúng tơi áp dụng quy trình xử lý mẫu như sau:
Lấy 6,0 mL n - hexan vào bình tam giác chứa 1,0 mL mẫu dầu thực vật, lắc đều, rung siêu âm 30 phút. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. Hút lấy dịch trong, chuyển toàn bộ vào phễu chiết
Thêm 2,0 mL nước cất siêu sạch, 6,0 mL DCM vào phễu chứa dịch trong, lắc 5 phút, để yên tách lớp, chiết lấy pha dưới
Thêm 6,0 mL n - hexan vào phễu chiết, lắc 5 phút, để yên tách lớp và chiết lấy pha trên. Thêm 1mL dung dịch NaCl 10% để
phá nhũ tương.
Gộp dịch chiết, thêm 15,0 g muối Na2SO4, lắc kỹ. Cô quay chân không đến khoảng 5,0 mL rồi thổi khô bằng N2 đến cạn.
Xác định mẫu trắng: mẫu dầu nành, dầu hỗn hợp và dầu oliu được thực hiện tất cả các bước theo quy trình. Trên cơ sở đo kết quả GC - MS/MS tìm ra mẫu khơng phát hiện phthalate để thực hiện các khảo sát tiếp theo.
2.4.7. Đánh giá phương pháp
2.4.7.1. Phân tích các dung dịch chuẩn tr n hệ thống GC - MS/MS
Tiêm lần lượt 1,0 μl các dung dịch chuẩn của 10 PAEs vào hệ thống GC- MS/MS. Thu thập các thông tin sau đây từ phần mềm xử lí số liệu của thiết bị: sắc đồ tổng ion (TIC), cửa sổ thời gian lưu cho từng cấu tử, thời gian lưu của từng cấu tử, diện tích peak của mảnh ion định lượng của từng cấu tử.
2.4.7.2. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
a. Giới hạn của thiết bị (IDL, IQL)
IDL (Instrumental detection limit) là lượng chất nhỏ nhất đưa vào máy mà detector có thể đo được và cho tín hiệu peak cao gấp 3 - 5 lần đường nền. IDL cho phép đánh giá thiết bị hoạt động có ổn định khơng, nó bao gồm các loại nhiễu từ linh kiện cơ - điện tử của thiết bị, điều kiện vận hành máy và điều kiện môi trường xung quanh và thường được ước lượng qua các dung dịch chuẩn.
IQL (Instrumental quantification limit) là lượng chất nhỏ nhất đưa vào máy để tạo tín hiệu của peak cao gấp khoảng 10 lần đường nền. Thông thường lấy IQL = 3IDL. IQL cho phép đánh giá thiết bị có đủ điều kiện để định lượng các cấu tử cần phân tích hay khơng và cho biết nồng độ cấu tử khi bơm vào máy có đủ điều kiện để định lượng hay không.
b. Giới hạn của phương pháp
Giới hạn phát hiện của phương pháp (method detection limit - viết tắt là MDL, hoặc Limit of Detection - viết tắt là LOD) là giá trị nồng độ thấp nhất của một chất cần phân tích có độ chính xác đến 99%, nồng độ chất cần phân tích lớn hơn 0 (Thông tư 21/2012/TT-BTNMT).
Trên cùng một phương pháp phân tích, các phịng thí nghiệm khác nhau sẽ cơng bố các giới hạn phát hiện khác nhau tuỳ thuộc vào tay nghề của nhân viên, sự hoạt
Trong trường hợp các yếu tố nêu trên không đảm bảo yêu cầu, giới hạn phát hiện của phương pháp sẽ tăng lên nhiều lần so với khuyến nghị của phương pháp gốc. Do đó, việc xác định và cơng bố giới hạn phát hiện của phương pháp sẽ thể hiện được năng lực của phịng thí nghiệm.
Giới hạn định lượng của phương pháp (method quantification limit) - viết tắt là MQL hoặc Limit of quantification - LOQ) là giới hạn thấp nhất của chất cần phân tích có thể định lượng được bằng cách phân tích đáp ứng được yêu cầu về độ chính xác. Giới hạn định lượng thường lớn hơn giới hạn phát hiện của phương pháp.
Giới hạn phát hiện (MDL) của một phương pháp phải được tính trên nền thật của mẫu và trải qua tồn bộ các bước xử lí mẫu. Do đó giá trị này chính xác nhất cho việc đánh giá một phương pháp phân tích. Có nhiều cách để xác định giới hạn phát hiện của phương pháp. Với nền mẫu phức tạp, việc xác định giới hạn của phương pháp (MDL, MQL) dựa trên tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu (S/N: signal/noise). Do đó, MDL = nồng độ thêm chuẩn nhỏ nhất vào nền mẫu tại đó có tỉ lệ S/N = 3; MQL = nồng độ thêm chuẩn nhỏ nhất vào nền mẫu tại đó có tỉ lệ S/N = 10.
2.4.7.3. Xác định hàm lượng PAEs trong mẫu
Các PAEs được định lượng bằng phương pháp đường chuẩn, khoảng tuyến tính xây dựng từ 0,1 - 100,0 µg/L. Hệ số tương quan R2 > 0,995. Hàm lượng 10 PAEs trong mẫu được tính tốn theo cơng thức:
Trong đó: X: hàm lượng PAEs (µg/kg hoặc µg/L) m: lượng mẫu (gam hoặc ml)
V: thể tích sau khi hịa cặn trước khi phân tích trên GC – MS/MS (mL) k: hệ số pha lỗng nếu có
2.4.7.4. Hiệu suất thu hồi
Xác định độ thu hồi: xác định PAEs trong nền mẫu thực có thêm chuẩn. Dựa vào đường chuẩn để tính tốn nồng độ thu được, từ đó xác định độ thu hồi của phương pháp nghiên cứu.
Dựa vào việc thêm chuẩnvào mẫu thử, cùng với việc tiến hành làm mẫu thực khơng có thêm chuẩn, hiệu suất thu hồi được tính theo cơng thức sau:
Trong đó: %H: hiệu suất thu hồi
CS+mẫu : nồng độ chuẩn IS thêm vào và mẫu thực có đo được. Cmẫu: nồng độ thực đo được.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu trên thiết bị
Định danh các phthalate trong hỗn hợp ở chế độ full scan. Dựa vào kết quả đo hỗn hợp 10 phthalate nồng độ 100 ppb ở chế độ full scan sau đó định danh từ thư viện chuẩn khối phổ NIST trên máy để xác nhận từng phthalate thông qua thời gian lưu và các mảnh ion tạo thành tương ứng. Dựa vào phổ full scan của hỗn hợp chúng tôi nhận thấy các đỉnh peak đều cao và rõ nét so với nền. Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi giữ nguyên điều kiện GC. Thông số 10 phthalate (bao gồm cả 3 chất nội chuẩn) được trình bày ở hình 5 và bảng 8.
Bảng 8. Thời gian lưu, mảnh ion và năng lượng bắn phá (CE) của các phthalates
Tên (STT peak) Thời gian lƣu (mảnh mẹ) Mảnh con CE(eV) Q/C Tên (STT peak) Thời gian lƣu (mảnh mẹ) Mảnh con CE(eV) Q/C DMP (1) 6,58 (163) 77,1 20 (Q) DnHP (6) 15,42 (149) 65,0 22 (Q) 51,1 14 (C) 93,0 16 (C) d4 - DMP 81,1 20 (Q) BzBP (7) 15,52 (206) 149,1 8 (Q) 139,1 10 (C) 93,0 16 (C) DEP (2) 8,16 (177) 149,0 8 (Q) DCHP (8) 16,90 (167) 149,1 8 (Q) 65,1 20 (C) 105,1 14 (C) DPP (3) 10,12 (149) 65,1 20 (Q) DEHP (9) 17,02 (167) (153) 149,0 6 (Q) 121,0 12 (C) 65,1 22 (C) DiBP (4) 12,00 (149) 65,1 22 (Q) d4 - DEHP 69,1 25 (Q) 121,0 12 (C) 125,1 15 (C) d4 - DiBP 69,1 20 (Q) DnOP (10) 18,42 (150) 66,1 22 (Q) 97,1 15 (C) DBP (5) 12,33 (149) 65,0 20 (Q) 93,0 16 (C)