Hiệu suất thu hồi Bậc tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương Chuẩn Fisher p Độ lệch chuẩn Tổng 20 145312,0 7265,59 Hằng số 1 143550,0 143550,0 Tổng đúng 19 1762,17 92,746 9,630 Hồi quy 6 1675,92 279,32 42,099 0,000 16,713 Phần dư 13 86,253 6,635 2,575 Tính khơng phù hợp 8 73,185 9,148 3,500 0,092 3,025 Lỗi lặp lại 5 13,068 2,614 1,617
3.4.2. Mặt đáp ứng ba chiều và các yếu tố ảnh hưởng
Mặt đáp ứng không gian 3 chiều và % ảnh hưởng của từng yếu tố đến hiệu suất thu hồi phtalate được thể hiện ở hình 7. Mặt đáp ứng không gian 3 chiều thể hiện sự ảnh hưởng, tương tác của 2 yếu tố đến hàm mục tiêu, hình a thể hiện sự ảnh hưởng kết hợp của tỷ lệ dung môi/mẫu và nồng độ NaCl, hình b cho thấy ảnh hưởng của nồng độ NaCl và thời gian chiết, tương tác của của tỷ lệ dung môi/mẫu và thời gian chiết được chỉ ra ở hình c. Nhìn chung, khi tăng giá trị của các biến thì hiệu suất quá trình chiết phtalate tăng và cuối cùng đạt đến trạng thái cân bằng.
a. b.
c. d.
Hình 7. Mơ hình tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết phthalate Phần trăm ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất chiết được thể hiện ở hình d. Phần trăm ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất chiết được thể hiện ở hình d. Kết quá cho thấy, sự ảnh hưởng của thời gian chiết là lớn nhất (57,2%), kế tiếp là tỉ lệ V dung môi/V mẫu (27,8%) và cuối cùng là nồng độ NaCl (15,0%).
Việc sử dụng RSM ngồi mục đích là đánh giá sự ảnh hưởng của các biến độc lập và sự tương tác của chúng đến hàm mục tiêu, bên cạnh đó là tìm ra điều kiện tối ưu cho quá trình xử lý mẫu. Kết quả được chỉ ra ở bảng 14. Thực hiện thí nghiệm tại điều kiện tối ưu, kết quả hiệu suất thu được là 91,1% (nằm trong khoảng tin cậy 95% của hiệu suất dự đoán). Điều này chứng tỏ mơ hình có ý nghĩa rất cao, cho phép dự đoán kết quả thực nghiệm tốt.
Bảng 14. Tối ưu hóa điều kiện chiết phtalate T lệ Vdung mơi/Vmẫu Số lần chiết C%NaCl Dung môi Phƣơng pháp làm giàu mẫu Thời gian chiết (ph t) % độ thu hồi Dự đoán Thực nghiệm 6.5 2 10 N - hexan Cô quay kết hợp thổi khô bằng N2 12 - 14 90,7 91,1
3.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp
Tiến hành xác định giá trị MDL, MQL bằng cách: thêm chuẩn mix 10 PAEs ở các nồng độ giảm dần vào mẫu thực, tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã tối ưu và phân tích trên hệ GC - MS/MS. Kết quả MDL, MQL được trình bày ở bảng 15.
Bảng 15. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của 10 PAEs (µg/kg)
So sánh với các giá trị MDL được công bố trong các nghiên cứu dùng detector MS, detector FID hay detector UV/VIS (MDL = 0,02 - 0,80 µg/kg) cho thấy giới hạn phát hiện (MDL = 0,01 – 0,05 µg/kg) và định lượng (MQL = 0,03 – 0,15 µg/kg) của phương pháp trong nghiên cứu này rất nhỏ, chứng tỏ phương pháp có độ nhạy rất tốt, cho phép phân tích 10 PAEs lượng siêu vết trong nền mẫu phức tạp như dầu ăn.
PAEs MDL MQL PAEs MDL MQL DMP 0,05 0,15 DnHP 0,02 0,06 DEP 0,01 0,03 BzBP 0,02 0,06 DPP 0,02 0,06 DCHP 0,01 0,03 DiBP 0,01 0,03 DEHP 0,01 0,03 DBP 0,01 0,03 DnOP 0,02 0,06
3.6. Đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp
Độ lặp lại của quá trình xử lý mẫu được thực hiện bằng cách xử lý 3 mẫu dầu ăn đồng thời theo quy trình trong 3 ngày liên tiếp. Kết quả (bảng 16) cho thấy % RSD < 5% vậy phương pháp phù hợp để xác định 10 phthalate.
Bảng 16. Kết quả tính độ lặp lại của phương pháp
PAEs Lần 1 (µg/kg) Lần 2 (µg/kg) Lần 3 (µg/kg) Trung bình (µg/kg) % RSD DMP 2,570 2,424 2,104 2,366 0,195 DEP 0,287 0,201 0,346 0,278 0,060 DPP 2,671 2,498 2,740 2,636 0,102 DiBP 2,357 2,127 2,249 2,244 0,094 DBP 0,931 0,884 0,786 0,867 0,060 DnHP 1,334 1,381 1,574 1,430 0,104 BzBP 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 DCHP 3,207 3,337 2,826 3,123 0,217 DEHP 2,350 2,546 2,481 2,459 0,082 DnOP 0,317 0,312 0,263 0,297 0,024
3.7. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp
Hiệu suất thu hồi của phương pháp xử lý mẫu là một trong những đại lượng quan trọng để đánh giá hiệu quả của phương pháp. Nó cho biết lượng chất bị mất đi trong quá trình phá mẫu. Đánh giá hiệu suất thu hồi là đánh giá độ tin cậy của phương pháp xử lý mẫu đã chọn.
Mẫu được chọn là mẫu dầu oliu, thêm nội chuẩn (d4 - DMP, d4 - DiBP và d4 - DEHP) ở 3 mức 2, 4 và 5µg/kg. Kết quả độ thu hồi trung bình thể hiện ở hình 8.
Bảng 17. Hiệu suất thu hồi với 3 mức thêm nội chuẩn
Nội chuẩn
Hiệu suất thu hồi (%) Hiệu suất thu hồi
trung bình (%)
2ppb 4ppb 5ppb
d4 - DMP 95,7 88,9 85,2 89,9 ± 5,16
d4 - DiBP 98,0 79,7 76,9 84,9 ± 11,17
d4 - DEHP 90,5 105,7 82,8 93,0 ± 11,34
Hình 8. Hiệu suất thu hồi trung bình (%) của 3 d4 - PAEs.
Độ thu hồi PAEs tính theo phương pháp nội chuẩn cho kết quả trong khoảng 79% - 106%, phù hợp với tiêu chuẩn quốc tế AOAC 2007.01 (H% = 70 – 120%). So sánh với một số nghiên cứu khác ở cùng nền mẫu dầu thực vật như xác định 6 PAEs [24] hay 2 PAEs [44] có độ thu hồi từ 87 – 112% (RSD < 15%). Với kết quả độ thu hồi trung bình > 80%, RSD < 12% chứng tỏ phương pháp GC – MS/MS phù hợp để định lượng PAEs.
3.8. Phân tích mẫu thực tế
Ba nhóm dầu ăn phổ biến trên thị trường được thu thập, xử lý và xác định đồng thời 10 PAEs bằng phương pháp GC - MS/MS. Kết quả phân tích hàm lượng 10 phthalate được trình bày ở bảng 19 và hình 9, 10.
Bảng 18. Thơng tin mẫu phân tích phthalate
STT Loại mẫu (số lượng) Kí hiệu Vật liệu chứa
1 Dầu thực vật hỗn hợp (9) VT Nhựa
2 Dầu nành (10) NT Nhựa
3 Dầu oliu (9) OL Thủy tinh
Bảng 19. Kết quả phân tích PAEs trong3 nhóm dầu thực vật (µg/kg)
Nhóm dầu PAEs OL NT VT Tổng (µg/kg) DMP 0,280 0,834 3,494 4,607 DEP 0,253 0,686 3,548 4,487 DPP 0,913 0,537 3,581 5,031 DiBP 0,455 0,641 3,565 4,661 DBP 0,340 0,580 3,429 4,349 DnHP 0,344 0,957 3,465 4,766 BzBP 0,253 1,010 3,857 5,120 DCHP 0,562 1,266 3,695 5,523 DEHP 0,597 4,158 3,552 8,307 DnOP 0,654 1,683 1,773 4,110 Tổng 10 PAEs (µg/kg) 3,462 6,932 23,429
Hình 9. Hàm lượng 10 PAEs trong 3 nhóm dầu thực vật
Tổng hàm lượng 10 PAEs ở 3 nhóm mẫu từ 4,652 - 33,959 µg/kg. Hàm lượng PAEs trong dầu oliu thấp nhất (0,253 - 0,913 µg/kg, trung bình 0,465µg/kg), tiếp đến nhóm dầu nành (0,537 - 4,158 µg/kg, trung bình 1,235µg/kg) và cao nhất ở nhóm dầu hỗn hợp (1,773 - 3,857µg/kg, trung bình 3,396µg/kg). Trong nghiên cứu của tác giả Shi và cộng sự (2015), với cùng vật liệu chứa là nhựa PET cho thấy tổng PAEs ở dầu oliu và dầu nành tương đương nhau [27, 28]. Do vậy sự chênh lệch tổng hàm lượng PAEs trong nghiên cứu này có thể xuất phát từ nguồn bao bì chứa mẫu: vật liệu làm bao bì là nhựa (nhựa PET - 01) có sự thơi nhiễm PAEs ra nền mẫu [23], trong khi bao bì vật liệu là thủy tinh hầu như khơng có [23, 40]. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của nhóm tác giả Sungur công bố năm 2015 [28] về ảnh hưởng của các loại dầu và vật liệu chứa (nhôm, thủy tinh, nhựa PET) đến sự thơi nhiễm của PAEs. Ngồi ra, PAEs trong dầu thực vật có thể xuất phát từ nhiều nguồn như mơi trường, khâu đóng gói hay vận chuyển.
Cùng loại vật liệu chứa là nhựa nhưng nhóm dầu thực vật tổng hợp có hàm lượng PAEs trung bình cao hơn 2,7 lần so với nhóm dầu đậu nành. Tại Việt Nam, dầu thực vật trên thị trường là hỗn hợp dầu cọ, dầu bắp, dầu nành và dầu hoa hướng dương. Việc bảo quản, pha trộn và đóng gói mất nhiều cơng đoạn hơn so với quá
trình sản xuất đơn lẻ một loại dầu đậu nành. Vì thế, lượng PAEs trong hỗn hợp dầu cũng sẽ cao hơn.
Hình 10. Tỉ lệ giữa nhóm (DEP, DEHP, DBP) và 7 PAEs còn lại
Tỷ lệ hàm lượng của nhóm PAEs phổ biến nhất (DEP, DEHP và DBP) so với 7 PAEs cịn lại cũng là một thơng số cần quan tâm. DEHP, DEP và DBP được quan tâm hơn các phthalate khác vì lý do độc tính của chúng đến sức khỏe. Nhiều nghiên cứu đã xác định 3 PAEs này trên nhiều nền mẫu: nước, sữa, thực phẩm béo, bao bì, khơng khí, trầm tích,... Phân tích 3 nhóm dầu thực vật cho thấy nhóm mẫu đựng trong chai nhựa có tổng (DEP + DBP + DEHP), cao hơn nhiều so với nhóm mẫu đựng trong chai thủy tinh. Điều này chứng minh việc thơi nhiễm PAEs ở dầu ăn có liên quan đến vật liệu chứa.
DEHP là một trong số các phthalate phổ biến nhất, cũng là một phthalate có độc tính cao nhất. DEHP đã được phát hiện trong nhiều loại dầu thực vật như dầu nành, dầu lạc, dầu vừng, dầu oliu, dầu hành nhân,… ở lượng vết hoặc siêu vết [1, 44, 46] Phân tích 3 nhóm mẫu dầu thực vật cho thấy hàm lượng DEHP từ 0,597 - 4,158µg/kg. Hàm lượng này thấp hơn giới hạn cho phép theo quyết định 2204/QĐ - B T năm 2011 về mức giới hạn nhiễm chéo DEHP trong thực phẩm.
KẾT LUẬN
Trong luận văn này, chúng tôi đã thu được các kết quả như sau:
Đã xây dựng quy trình phân tích đồng thời 10 phthalate: DMP, DEP, DPP, DBP, DiBP, DCHP, BzBP, DnHP, DEHP và DnOP trong mẫu dầu thực vật bằng phương pháp sắc kí khí ghép nối 2 lần khối phổ.
Điều kiện GC – MS/MS như sau: pha tĩnh là cột sắc ký mao quản hợp nhất silica không phân cực, chương trình nhiệt tối ưu cho phân tích PAEs; chế độ tiêm mẫu khơng chia dịng trong 1phút; khí mang Heli; nhiệt độ bộ phận kết nối sắc ký khí và khối phổ: 3100C, thể tích tiêm mẫu 1 μL; kỹ thuật ion hóa bắn phá điện tử EI 70 eV. Thời gian lấy tín hiệu: 0 – 20 phút.
Quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng lỏng với dung môi n - hexan, tỉ lệ thể tích dung mơi/mẫu = 6, số lần chiết = 2, thời gian chiết 10 phút sử dụng dung dịch NaCl 10% để phá nhũ tương và giai đoạn làm giàu mẫu bằng cô quay chân khơng + thổi khơ bằng khí N2.
Đánh giá phương pháp: giới hạn phát hiện (MDL) 0,01 – 0,05 µg/kg, giới hạn định lượng (MQL): 0,03 - 0,15 µg/kg, độ thu hồi trung bình > 80% (với % RSD < 12%); độ lặp có % RSD < 5% chứng tỏ phương pháp có độ nhạy và độ chính xác tốt, phù hợp để phân tích 10 PAEs trong nền mẫu dầu thực vật.
Xác định hàm lượng các phthalates trong dầu thực vật hỗn hợp, dầu đậu nành và dầu oliu (n = 28). Kết quả cho thấy: tổng hàm lượng 10 PAEs ở 3 nhóm mẫu dao động từ 4,65 - 33,96 µg/kg. Hàm lượng PAEs trong dầu oliu thấp nhất (0,25 - 0,91 µg/kg, trung bình 0,47µg/kg), tiếp đến nhóm dầu nành (0,54 - 4,16 µg/kg, trung bình 1,24 µg/kg) và cao nhất ở nhóm dầu hỗn hợp (1,77 - 3,86 µg/kg, trung bình 3,4 µg/kg). Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu đã công bố khi xét đến lý do sự có mặt của PAEs trong dầu thực vật xuất phát từ vật liệu chứa (chủ yếu), từ môi trường, phương pháp bảo quản,… Hàm lượng DEHP trong các mẫu nhỏ hơn giới hạn cho phép theo quyết định 2204/QĐ - B T năm 2011.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Barp, Laura, et al. (2015), "Determination of phthalate esters in vegetable oils using direct immersion solid-phase microextraction and fast gas chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry", Analytica Chimica Acta. 887, pp. 237-244.
2. Bell, F. P. (1982), "Effects of phthalate esters on lipid metabolism in various tissues, cells and organelles in mammals", Environmental Health Perspectives. 45, pp. 41-50.
3. Blount, B. C., et al. (2000), "Levels of seven urinary phthalate metabolites in a human reference population", Environmental Health Perspectives. 108(10), pp. 979-982.
4. Bornehag, Carl-Gustaf, et al. (2015), "Prenatal Phthalate Exposures and Anogenital Distance in Swedish Boys", Environmental Health Perspectives.
123(1), pp. 101-107.
5. Bornehag, Carl-Gustaf, et al. (2004), "The Association between Asthma and Allergic Symptoms in Children and Phthalates in House Dust: A Nested Case– Control Study", Environmental Health Perspectives. 112(14), pp. 1393-1397. 6. Botelho, Giuliana G. K., et al. (2009), "Reproductive Effects of Di(2-
ethylhexyl)phthalate in Immature Male Rats and Its Relation to Cholesterol, Testosterone, and Thyroxin Levels", Archives of Environmental Contamination
and Toxicology. 57(4), pp. 777-784.
7. Chou, Karen and Wright, Robert O. (2006), "Phthalates in food and medical devices", Journal of Medical Toxicology. 2(3), pp. 126-135.
8. Culty, Martine, et al. (2008), "In Utero Exposure to Di-(2-ethylhexyl) Phthalate Exerts Both Short-Term and Long-Lasting Suppressive Effects on Testosterone Production in the Rat1", Biology of Reproduction. 78(6), pp. 1018-1028.
9. Duty, Susan M., et al. (2003), "The relationship between environmental exposures to phthalates and DNA damage in human sperm using the neutral comet assay", Environmental Health Perspectives. 111(9), pp. 1164-1169. 10. Ema, M., Amano, H., and Ogawa, Y. (1994), "Characterization of the
developmental toxicity of di-n-butyl phthalate in rats", Toxicology. 86(3), pp.
163-74.
11. Fan, Yingying, et al. (2017), "Analysis of phthalate esters in dairy products—a brief review", Analytical Methods. 9(3), pp. 370-380.
12. Foster, Melanie, et al. (2009), Reproductive Toxicity and Pharmacokinetics of di-n-butyl Phthalate (DBP) Following Dietary Exposure of Pregnant Rats, Vol.
13. Gray, Jr L. Earl, et al. (2000), "Perinatal Exposure to the Phthalates DEHP, BBP, and DINP, but Not DEP, DMP, or DOTP, Alters Sexual Differentiation of the Male Rat", Toxicological Sciences. 58(2), pp. 350-365.
14. Guo, Ying, et al. (2011), "Occurrence of Phthalate Metabolites in Human Urine from Several Asian Countries", Environmental Science & Technology. 45(7),
pp. 3138-3144.
15. Guo, Ying, Wang, Lei, and Kannan, Kurunthachalam (2013), Phthalates and Parabens in Personal Care Products From China: Concentrations and Human Exposure, Vol. 66.
16. Holadová, K. and Hajšlová, J. (1995), "A Comparison of Different Ways of Sample Preparation for the Determination of Phthalic Acid Esters in Water and Plant Matrices", International Journal of Environmental Analytical Chemistry.
59(1), pp. 43-57.
17. Huang, Po-Chin, et al. (2009), "Association between prenatal exposure to phthalates and the health of newborns", Environ Int. 35(1), pp. 14-20.
18. Klaunig, James E., et al. (2003), "PPARα Agonist-Induced Rodent Tumors: Modes of Action and Human Relevance", Critical Reviews in Toxicology.
33(6), pp. 655-780.
19. Knauer (2011), "Determination of Phthalates", Applications Journal, p. 32. 20. Mortensen, Gerda K., et al. (2005), "Determination of phthalate monoesters in
human milk, consumer milk, and infant formula by tandem mass spectrometry (LC–MS–MS)", Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382(4), pp. 1084-
1092.
21. Nazir, Sadia, et al. (2018), "Women Diagnosed with Endometriosis Show High Serum Levels of Diethyl Hexyl Phthalate", Journal of human reproductive sciences. 11(2), pp. 131-136.
22. Orsi, D. De, et al. (2006), "A environmentally friendly reversed-phase liquid chromatography method for phthalates determination in nail cosmetics",
Analytica Chimica Acta. 555(2), pp. 238-241.
23. Rastkari, Noushin, et al. (2017), "The Effect of Storage Time, Temperature and Type of Packaging on the Release of Phthalate Esters into Packed Acidic Liquids", Food Technology and Biotechnology. 55(4), pp. 562-569.
24. Rios, J. J., Morales, A., and Márquez-Ruiz, G. (2010), "Headspace solid-phase microextraction of oil matrices heated at high temperature and phthalate esters determination by gas chromatography multistage mass spectrometry", Talanta.
80(5), pp. 2076-2082.
25. Russo, Mario Vincenzo (2015), "Extraction and GC-MS analysis of phthalate esters in food matrices: a review", Royal Society of chemistry. 5.
26. Sathyanarayana, S. (2008), "Phthalates and children's health", Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care. 38(2), pp. 34-49.
27. Shi, Long-Kai, Zhang, Ming-Ming, and Liu, Yu-Lan (2016), Concentration and
survey of phthalic acid esters in edible vegetable oils and oilseeds by gas chromatography-mass spectrometry in China, Vol. 68.
28. Sungur, Sana, et al. (2015), "Migrated phthalate levels into edible oils", Food Additives & Contaminants: Part B. 8(3), pp. 190-194.
29. Swaen, Gerard M. H. and Otter, Rainer (2016), "Letter to the Editor: Phthalates and Endometriosis", The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism.
101(11), pp. L108-L109.
30. Swan, Shanna H., et al. (2005), "Decrease in anogenital distance among male infants with prenatal phthalate exposure", Environmental Health Perspectives. 113(8), pp. 1056-1061.
31. Upson, Kristen, et al. (2013), "Phthalates and risk of endometriosis",
Environmental Research. 126, pp. 91-97.
32. van Wezel, A. P., et al. (2000), "Environmental Risk Limits for Two Phthalates, with Special Emphasis on Endocrine Disruptive Properties", Ecotoxicology and
Environmental Safety. 46(3), pp. 305-321.
33. Wenzl, Thomas (2009), "Methods for the determination of phthalates in food",