CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.6. Nghiên cứu một số tính chất của enzyme acetylcholinesterase
Sau khi đã thu đƣợc AChE tinh sạch, tiến hành nghiên cứu tính chất của AChE trong một số điều kiện pH, nhiệt độ khác nhau với mục đích nhằm tối ƣu môi trƣờng phản ứng và điều kiện bảo quản của AChE.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
16 mg cơ chất acetylthiocholine iodide đƣợc pha trong 40 ml axit xanh (hỗn hợp chất sinh màu và cơ chất). Tiếp theo, 0,05 ml dịch chiết chứa AChE đƣợc bổ sung vào 2,5 ml hỗn hợp chất sinh màu và cơ chất. Điều kiện nhiệt độ phản ứng đƣợc thay đổi khác nhau (từ 20oC đến 70o
C) theo các bậc thay đổi là 5oC trong 30 phút. Hoạt độ của AChE đƣợc xác định theo phƣơng pháp trình bày trong mục 2.2.2.2.
2.2.6.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của AChE
1,38 g axit xanh đƣợc pha trong 40 ml đệm phosphate 0,02M có pH khác nhau (từ 5 đến 10) theo các bậc thay đổi là 0,5, đƣợc điều chỉnh bằng dung dịch NaOH, HCl. Tiếp theo, 16 mg cơ chất acetylthiocholine iodide đƣợc bổ sung vào dung dịch trên. Sau đó, 0,05 ml dịch chiết chứa AChE đƣợc bổ sung vào 2,5 ml hỗn hợp cơ chất và chất sinh màu. Hoạt độ của AChE đƣợc xác định theo phƣơng pháp trình bày trong mục 2.2.2.2.
2.2.7. Phương pháp tách chiết mRNA tổng số
Trong nghiên cứu này RNA được tách và tinh sạch từ các mẫu máu bò theo kit của Qiagen. Quy trình thực hiện như sau:
Dịch chiết máu bị (400 µl) đã đƣợc tách sẵn từ máu tổng số đƣợc chuyển sang ống eppendorf, 400 µl dung dịch đệm phosphate chứa muối (PBS) và 640 µl đệm AC, 0,56 µl dung dịch chất mang RNA (RNA carrier) đƣợc bổ sung nhằm tăng khả năng gắn RNA virus, hỗn hợp đƣợc trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút. Mẫu sau đó đƣợc ly tâm ở 3.000 vịng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng để loại bỏ dịch nổi. Kết tủa đƣợc hồ tan trở lại trong 240 µl đệm AR đã đƣợc làm nóng tới 60oC, 16 µl proteinase K đƣợc bổ sung, hỗn hợp đƣợc trộn đều trên máy vortex 3-5 lần, mỗi lần 5-10 giây. Tiếp theo, hỗn hợp đƣợc ủ tiếp ở 40oC trong 10 phút và lắc đều cứ sau 5 phút 1 lần. 240 µl đệm AB đƣợc bổ sung vào hỗn hợp và trộn đều bằng máy vortex. Sau đó, hỗn hợp đƣợc đƣa vào cột QIAamp Spin và đƣợc ly tâm ở 7000 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt độ phịng. Cột sau đó đƣợc chuyển sang ống eppendorf mới và đƣợc rửa 2 lần bằng đệm AW1 và AW2 kết hợp ly tâm ở 14.000
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
vòng/phút trong 3 phút. Cuối cùng, cột đƣợc chuyển sang một ống eppendorf mới. 60 µl đệm AVE đƣợc bổ sung, hỗn hợp đƣợc ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 1 phút để thu hồi lại RNA. Mẫu đƣợc bảo quản ở -20oC đến khi sử dụng.
2.2.8. Phương pháp tổng hợp cDNA
RNA của máu bò đƣợc chuyển thành cDNA bằng enzyme M-MLV reverse transcriptase của hãng Enzynomics. cDNA đƣợc tổng hợp theo quy trình: 10
l RNA của máu bò và 1 l mồi ngẫu nhiên (0,2 g) đƣợc biến tính ở 70o
C trong 5 phút, làm lạnh trên đá. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc bổ sung 2 l đệm M-MLV reverse transcriptase 10x, 2,5 l dNTPs 2 mM, 3,5 l H2O, 0,5 µl chất ức chế ribonuclease và 0,5 l M-MLV reverse transcriptase rồi ủ ở 37oC trong 90 phút. Phản ứng đƣợc kết thúc bằng xử lý nhiệt ở 70oC trong 10 phút và làm lạnh trên đá. Các mẫu cDNA đƣợc bảo quản ở -20oC để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.9. Phương pháp PCR
Mỗi phản ứng PCR (25 l) chứa các thành phần dƣới đây:
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích
Đệm Taq DNA polymerase 10X 2,5 l
Taq DNA polymerase 0,5 l
dNTPs 2mM 2,5 l AChE Fw 10 pmol 1 l AChE Rv10 pmol 1 l cDNA khuôn 1,5 l dd H2O 16 l Tổng thể tích 25 l
Hỗn hợp đƣợc trộn đều và đặt vào máy PCR. Chu trình nhiệt đƣợc điều chỉnh nhƣ sau:
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
2.2.10. Điện di trên gel agarose
Gel agarose 1%, 2% đƣợc chuẩn bị trong đệm TAE với nồng độ EDTA 12 mM để tránh sự phân cắt DNA bởi nuclease. Mẫu DNA đƣợc trộn với đệm mẫu chứa sẵn 50 g/ml ethidium bromide. Điện di đƣợc tiến hành với điện thế ổn định
khoảng 10 volt/cm gel và chạy trong vòng 25-30 phút. Sau khi kết thúc điện di bản gel đƣợc lấy ra soi dƣới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp ảnh gel Doc (Bio-Rad).
2.2.11. Phương pháp nhân dòng vào vector pGEMT
Sản phẩm của phản ứng PCR nhân bản đoạn gen mã hóa cho enzyme AChE sau khi đã kiểm tra trên gel agarose 1% đƣợc gắn trực tiếp vào vector nhân dòng pGEMT theo kit của Promega. Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm vào vector đầu T trên tổng thể tích 10 l nhƣ sau:
- Sản phẩm PCR: 2 l
- Đệm T4 DNA ligase 10X: 1 l, - T4 DNA ligase: 1 l,
- Vector đầu T: 1 l,
- H2O cất khử trùng, khử ion: 5 l
Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 4oC trong 12h và giữ ở nhiệt độ -20oC, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5.
2.2.12. Biến nạp vector chứa đoạn gen chèn vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5 DH5
Biến nạp bằng phƣơng pháp sốc nhiệt vào tế bào E. coli khả biến: tế bào khả biến E. coli chủng DH5 (bảo quản ở -80oC) đƣợc lấy ra để trên đá 10 - 20 phút cho tan dần. Hỗn hợp phản ứng gắn đoạn gen AChE vào vector pGEMT đƣợc bổ sung vào, trộn nhẹ và để trên đá 20 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào, sau đó đƣợc sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây và đƣợc chuyển ngay lên đá 2 phút. 300 - 500 l môi trƣờng LB lỏng đƣợc bổ sung vào hỗn hợp biến nạp. Mẫu sau đó đƣợc giữ trong tủ ấm 37oC trong 10 phút và lắc ở tốc độ 150 vòng/phút, 37o
C trong 35 chu kỳ
94oC-40 giây 45oC-45 giây 72oC-90 giây
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
50 phút. 50 - 100 l hỗn hợp biến nạp đƣợc cấy trải tế bào trên đĩa petri chứa mơi trƣờng LB đặc có 50 g/ml ampicillin, 20 l X-gal 20 mg/ml và 20 l IPTG 100
mM và ni trong tủ ấm 37oC trong 12h (Hình 2.1).
Hình 2.1. Nhân dịng đoạn gen mã hóa cho AChE vào vector pGEM T 2.2.13. Phương pháp giải trình tự
Giải trình tự đƣợc tiến hành qua 2 bƣớc: bƣớc PCR thông thƣờng để khuếch đại đoạn trình tự cần đọc và bƣớc PCR cho xác định trình tự.
Plasmid tinh sạch đƣợc sử dụng làm khn cho PCR thông thƣờng (PCR lần 1) với cặp mồi M13-Fw và M13-Rv (có trình tự nằm trên vector pGEM-T) để khuếch đại đoạn trình tự cần đọc. Sản phẩm PCR lần 1 đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 2% và pha lỗng ở nồng độ thích hợp (khoảng 50-100 pmol) đƣợc dùng làm khuôn cho PCR trong xác định trình tự (PCR lần 2).
Thành phần phản ứng PCR cho xác định trình tự gồm:
- Hỗn hợp DTCS (Dye terminator cycle sequencing) Master mix: 4 l - Khuôn: 0,5 l
- Mồi M13 Fw/Rv: 1 l
- H2O khử trùng, khử ion: 20 l
PCR đƣợc thực hiện nhƣ sau: duy trì ở nhiệt độ 96oC trong 1 phút để khởi động nóng ban đầu tiếp theo là 30 chu kỳ gồm 3 bƣớc: duy trì 96oC trong 20 giây để làm biến tính DNA, ở 56oC trong 30 giây để gắn mồi, ở 60oC trong 4 phút để kéo
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
dài chuỗi. Mẫu sau đó đƣợc ủ tiếp ở 60oC trong 7 phút và giữ ở 4oC cho đến khi phân tích.
Sản phẩm PCR lần 2 đƣợc xử lý trƣớc khi đƣa vào máy đọc trình tự. Quá trình xử lý mẫu gồm các bƣớc sau:
- Dung dịch dừng phản ứng đƣợc chuẩn bị ngay trƣớc khi dùng bao gồm: 20 l Kali-acetate 3 M, pH 5,2; 20 l EDTA 100 mM, pH 8; 10 l glycogen và trộn đều. 5 l dung dịch dừng phản ứng đƣợc bổ sung vào mỗi ống sản phẩm phản ứng PCR và trộn đều thật kỹ.
- 60 l ethanol 95% giữ ở -20oC đƣợc bổ sung vào hỗn hợp và trộn đều. Sau đó, hỗn hợp phản ứng đƣợc ly tâm ngay ở 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC. Dịch nổi đƣợc hút bỏ nhẹ nhàng và thu kết tủa. Kết tủa đƣợc rửa 2 lần, mỗi lần bằng 200 l ethanol 70% giữ ở -20oC và đƣợc ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Dịch nổi sau ly tâm đƣợc hút bỏ cẩn thận bằng pipet, thu kết tủa và đƣợc để khơ ở nhiệt độ phịng. Kết tủa đƣợc hoà tan trở lại bằng 40 l dung dịch
đệm tra mẫu SLS (sample loading solution). Mẫu sau khi xử lý đƣợc giải trình tự bằng hệ thống đọc trình tự CEQ-8000 của hãng Beckman Coulter.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát hoạt độ của acetylcholinesterase ở một số sinh vật 3.1. Khảo sát hoạt độ của acetylcholinesterase ở một số sinh vật
Chúng tôi cũng tiến hành khảo sát sự phân bố cũng nhƣ hoạt độ của AchE này trong một số mẫu sinh vật khác nhau: ngan, gà, lợn, bị. Kết quả đƣợc trình bày trong hình 3.1.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 3.1. Hoạt độ AChE ở một số đối tƣợng nghiên cứu
Từ kết quả xác định hoạt độ AChE có ở cả 4 mẫu máu sinh vật đã khảo sát (hình 3.3), nhận thấy hoạt độ AChE giữa các mẫu máu là tƣơng đối thấp (hoạt độ AChE < 0,05 U/mg nguyên liệu tƣơi). Hoạt độ AChE trong mẫu máu của các động vật máu nóng cao hơn hoạt độ AChE ở động vật biến nhiệt. Hoạt độ của AChE trong hồng cầu bò là cao nhất đạt 0,024 U/mg nguyên liệu tƣơi. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết công bố trong tài liệu [2, 3]. Bên cạnh đó, máu bị là nguồn nguyên liệu rẻ tiền, phổ biến, dễ mua với số lƣợng lớn nên thuận lợi là nguồn nguyên liệu ổn định cho mục đích sản xuất và tinh sạch chế phẩm AChE.
3.2. Tinh sạch enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bị
Với mục đích chế tạo chế phẩm AChE chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm tinh sạch AChE từ máu bị. Quy trình tinh sạch tiến hành theo hai bƣớc:
Bƣớc 1: Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion DEAE - Sepharose Bƣớc 2: Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel qua cột SephadexTM
G75
3.2.1. Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose
Để tinh sạch AChE thu đƣợc từ máu bò, tiến hành thu dịch chiết trong đệm phosphate 20mM, pH 8 và cho sắc ký trao đổi ion qua cột gel DEAE -
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
sepharose có kích thƣớc 3,815cm, đƣợc cân bằng với cùng đệm trên. Kết quả phân tích protein và hoạt độ AChE của các phân đoạn sắc ký qua cột cho thấy phần dịch không hấp thụ khơng có hoạt độ AChE. Phần protein gắn trên cột đƣợc rửa chiết bằng gradient NaCl từ 20mM - 1000mM pha trong 300 ml đệm phosphate 20mM, pH 8. Kết quả đƣợc trình bày trên hình 3.2.
Hình 3.2. Sắc ký đồ trao đổi ion qua cột DEAE - sepharose tinh sạch AChE từ hồng cầu
bò
Hàm lƣợng protein trong các phân đoạn rửa chiết (mgPr/ml) Hoạt độ riêng AChE trong các phân đoạn rửa chiết (U/mg)
Kết quả trên hình 3.2 cho thấy có ba đỉnh protein khơng tách biệt rõ ràng (phân đoạn 40 – 50). Các đỉnh này kế tiếp nhau và có sự gối lên nhau nên có thể thấy chúng hợp thành một đỉnh lớn. Điều này chứng tỏ rằng các protein trong dịch thô thu đƣợc ở pH 8 khơng có sự sai khác lớn về điện tích.
Kết quả xác định hoạt độ AChE cho thấy chỉ có một đỉnh hoạt độ AChE đƣợc đẩy ra từ phân đoạn 22 đến phân đoạn 30 tƣơng ứng với nồng độ NaCl ở khoảng 160 – 210 mM. Đỉnh hoạt độ đƣợc đẩy ra trƣớc các phân đoạn có hàm lƣợng protein cao. Qua bƣớc thí nghiệm này đã loại bỏ đƣợc 96,4% protein khơng
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
mong muốn trong dịch chiết thô ban đầu. Hoạt độ riêng của chế phẩm AChE sau khi qua bƣớc này đã tăng lên 7 lần so với ban đầu (bảng 3.1). Các phân đoạn có hoạt độ enzyme cao nhất đƣợc dồn lại (phân đoạn 22 – 30) và dùng làm nguyên liệu cho bƣớc tinh sạch tiếp theo.
3.2.2. Tinh sạch enzyme Acetylcholinesterase qua cột Sephadex TM G-75
Để tiếp tục tinh sạch AChE của hồng cầu bò, tiến hành tập trung các phân đoạn có hoạt độ AChE sau khi qua cột DEAE - sepharose, cô đặc mẫu bằng màng cô mẫu và cho sắc ký qua cột lọc gel SephadexTM G-75. Kết quả đƣợc trình bày trên hình 3.3.
Hình 3.3. Sắc ký đồ lọc gel qua cột Sephadex G75 để tinh sạch AChE từ hồng cầu bò
Hàm lƣợng protein trong các phân đoạn rửa chiết (mgPr/ml) Hoạt độ riêng AChE trong các phân đoạn rửa chiết (U/mg)
Kết quả ở hình 3.3 cho thấy sắc ký đồ có ba đỉnh protein trải rộng từ phân đoạn 38 đến phân đoạn 59. Hoạt độ AChE cũng xuất hiện với một đỉnh duy nhất trùng với đỉnh protein thứ nhất từ phân đoạn 39 đến phân đoạn 42 (tƣơng ứng với 8 ml thể tích rửa chiết). Tổng lƣợng protein và hoạt độ AChE của phần này tƣơng ứng là 3,12 mg protein và 387 U. Qua bƣớc sắc ký lọc gel có thể nhận thấy rằng sử dụng
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
sắc ký lọc gel SephadexTM G-75 đã cho phép loại bỏ đƣợc 70,3% protein không mong muốn trong chế phẩm đã qua cột DEAE - sepharose. Đồng thời hoạt độ riêng của chế phẩm AChE sau khi qua bƣớc này đã tăng lên 13,5 lần so với ban đầu. Kết quả thu đƣợc qua các bƣớc tinh sạch AChE từ hồng cầu bò đƣợc trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tóm tắt kết quả thu đƣợc qua các bƣớc tinh sạch AChE từ hồng cầu bò Các bƣớc tinh sạch Protein tổng số (mg) Hoạt độ tổng số (U) Hoạt độ riêng (U/mgpr) Độ sạch Hiệu suất (%) Dịch thô 292 2686,4 9,2 1,0 100 Qua cột DEAE- sepharose 10,5 676,8 64,6 7,02 25,2 Qua cột Sephadex G75 3,12 387 124 13,47 14,4
Từ kết quả bảng 3.1 cho thấy qua 2 bƣớc tinh sạch từ hồng cầu bò thu đƣợc dịch chiết có chứa AChE có hoạt độ và độ tinh sạch khá cao. Có thể so sánh với một số nghiên cứu khác nhƣ sau:
Đối với trong nƣớc, hiện đã có một số cơng trình nghiên cứu tách chiết và tinh sạch AChE từ các nguồn khác nhau. Theo tài liệu [3] AChE đã đƣợc tách chiết từ ốc bƣơu vàng và tinh sạch qua hai bƣớc: bƣớc thứ nhất là kết tủa bằng tác ethanol, aceton và muối amoni sunfat; bƣớc thứ hai là chạy sắc ký trao đổi ion cột DEAE-cellulose. Kết quả tinh sạch thu đƣợc các phân đoạn 22 và 23 có hoạt độ cao nhất là 1,83 U/mg. Theo tài liệu [1] BuChE từ huyết thanh ngựa cũng đã đƣợc tinh sạch qua hai giai đoạn: kết tủa phân đoạn bằng muối amonisunphat (3 bƣớc) và sử dụng sắc ký trao đổi ion với loại nhựa trao đổi là DEAE Sepharose fast flow trong các điều kiện khác nhau (2 bƣớc). Kết quả đã tạo ra đƣợc chế phẩm BChE có hoạt độ riêng đạt 150 U/mg và có độ sạch gấp 2941 lần so với nguyên liệu đầu vào.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Trên thế giới, tinh sạch AChE đƣợc thực hiện theo nhiều phƣơng pháp khác nhau [5, 36, 62], AChE đã đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp sắc ký ái lực phối tử ức chế là kháng thể cố định [42, 45, 75] procainamide, tacrine, methylaminophenylamine và những kháng thể đặc hiệu methylacridine [20] từ tế bào sợi ở phổi ngƣời nối với giá thể là Sepharose 6 CNBr-Sepharose [42]. Ngoài ra, AChE cũng đã đƣợc tinh sạch bằng cách giữ lại trên cột ái lực và đẩy ra bằng procainamide, sau đó đƣợc phân tách tiếp bằng sắc ký trao đổi ion [45, 75] (Bảng 3.2)
Bảng 3.2. Một số kết quả nghiên cứu tinh sạch enzyme AChE STT Đối tƣợng tinh sạch Phƣơng pháp tinh sạch Hoạt độ AChE (U/mg) Độ sạch Hiệu suất