CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Tinh sạch enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò
Với mục đích chế tạo chế phẩm AChE chúng tơi đã tiến hành thử nghiệm tinh sạch AChE từ máu bị. Quy trình tinh sạch tiến hành theo hai bƣớc:
Bƣớc 1: Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion DEAE - Sepharose Bƣớc 2: Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel qua cột SephadexTM
G75
3.2.1. Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose
Để tinh sạch AChE thu đƣợc từ máu bò, tiến hành thu dịch chiết trong đệm phosphate 20mM, pH 8 và cho sắc ký trao đổi ion qua cột gel DEAE -
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
sepharose có kích thƣớc 3,815cm, đƣợc cân bằng với cùng đệm trên. Kết quả phân tích protein và hoạt độ AChE của các phân đoạn sắc ký qua cột cho thấy phần dịch không hấp thụ khơng có hoạt độ AChE. Phần protein gắn trên cột đƣợc rửa chiết bằng gradient NaCl từ 20mM - 1000mM pha trong 300 ml đệm phosphate 20mM, pH 8. Kết quả đƣợc trình bày trên hình 3.2.
Hình 3.2. Sắc ký đồ trao đổi ion qua cột DEAE - sepharose tinh sạch AChE từ hồng cầu
bò
Hàm lƣợng protein trong các phân đoạn rửa chiết (mgPr/ml) Hoạt độ riêng AChE trong các phân đoạn rửa chiết (U/mg)
Kết quả trên hình 3.2 cho thấy có ba đỉnh protein khơng tách biệt rõ ràng (phân đoạn 40 – 50). Các đỉnh này kế tiếp nhau và có sự gối lên nhau nên có thể thấy chúng hợp thành một đỉnh lớn. Điều này chứng tỏ rằng các protein trong dịch thô thu đƣợc ở pH 8 khơng có sự sai khác lớn về điện tích.
Kết quả xác định hoạt độ AChE cho thấy chỉ có một đỉnh hoạt độ AChE đƣợc đẩy ra từ phân đoạn 22 đến phân đoạn 30 tƣơng ứng với nồng độ NaCl ở khoảng 160 – 210 mM. Đỉnh hoạt độ đƣợc đẩy ra trƣớc các phân đoạn có hàm lƣợng protein cao. Qua bƣớc thí nghiệm này đã loại bỏ đƣợc 96,4% protein khơng
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
mong muốn trong dịch chiết thô ban đầu. Hoạt độ riêng của chế phẩm AChE sau khi qua bƣớc này đã tăng lên 7 lần so với ban đầu (bảng 3.1). Các phân đoạn có hoạt độ enzyme cao nhất đƣợc dồn lại (phân đoạn 22 – 30) và dùng làm nguyên liệu cho bƣớc tinh sạch tiếp theo.
3.2.2. Tinh sạch enzyme Acetylcholinesterase qua cột Sephadex TM G-75
Để tiếp tục tinh sạch AChE của hồng cầu bị, tiến hành tập trung các phân đoạn có hoạt độ AChE sau khi qua cột DEAE - sepharose, cô đặc mẫu bằng màng cô mẫu và cho sắc ký qua cột lọc gel SephadexTM G-75. Kết quả đƣợc trình bày trên hình 3.3.
Hình 3.3. Sắc ký đồ lọc gel qua cột Sephadex G75 để tinh sạch AChE từ hồng cầu bò
Hàm lƣợng protein trong các phân đoạn rửa chiết (mgPr/ml) Hoạt độ riêng AChE trong các phân đoạn rửa chiết (U/mg)
Kết quả ở hình 3.3 cho thấy sắc ký đồ có ba đỉnh protein trải rộng từ phân đoạn 38 đến phân đoạn 59. Hoạt độ AChE cũng xuất hiện với một đỉnh duy nhất trùng với đỉnh protein thứ nhất từ phân đoạn 39 đến phân đoạn 42 (tƣơng ứng với 8 ml thể tích rửa chiết). Tổng lƣợng protein và hoạt độ AChE của phần này tƣơng ứng là 3,12 mg protein và 387 U. Qua bƣớc sắc ký lọc gel có thể nhận thấy rằng sử dụng
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
sắc ký lọc gel SephadexTM G-75 đã cho phép loại bỏ đƣợc 70,3% protein không mong muốn trong chế phẩm đã qua cột DEAE - sepharose. Đồng thời hoạt độ riêng của chế phẩm AChE sau khi qua bƣớc này đã tăng lên 13,5 lần so với ban đầu. Kết quả thu đƣợc qua các bƣớc tinh sạch AChE từ hồng cầu bò đƣợc trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tóm tắt kết quả thu đƣợc qua các bƣớc tinh sạch AChE từ hồng cầu bò Các bƣớc tinh sạch Protein tổng số (mg) Hoạt độ tổng số (U) Hoạt độ riêng (U/mgpr) Độ sạch Hiệu suất (%) Dịch thô 292 2686,4 9,2 1,0 100 Qua cột DEAE- sepharose 10,5 676,8 64,6 7,02 25,2 Qua cột Sephadex G75 3,12 387 124 13,47 14,4
Từ kết quả bảng 3.1 cho thấy qua 2 bƣớc tinh sạch từ hồng cầu bò thu đƣợc dịch chiết có chứa AChE có hoạt độ và độ tinh sạch khá cao. Có thể so sánh với một số nghiên cứu khác nhƣ sau:
Đối với trong nƣớc, hiện đã có một số cơng trình nghiên cứu tách chiết và tinh sạch AChE từ các nguồn khác nhau. Theo tài liệu [3] AChE đã đƣợc tách chiết từ ốc bƣơu vàng và tinh sạch qua hai bƣớc: bƣớc thứ nhất là kết tủa bằng tác ethanol, aceton và muối amoni sunfat; bƣớc thứ hai là chạy sắc ký trao đổi ion cột DEAE-cellulose. Kết quả tinh sạch thu đƣợc các phân đoạn 22 và 23 có hoạt độ cao nhất là 1,83 U/mg. Theo tài liệu [1] BuChE từ huyết thanh ngựa cũng đã đƣợc tinh sạch qua hai giai đoạn: kết tủa phân đoạn bằng muối amonisunphat (3 bƣớc) và sử dụng sắc ký trao đổi ion với loại nhựa trao đổi là DEAE Sepharose fast flow trong các điều kiện khác nhau (2 bƣớc). Kết quả đã tạo ra đƣợc chế phẩm BChE có hoạt độ riêng đạt 150 U/mg và có độ sạch gấp 2941 lần so với nguyên liệu đầu vào.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Trên thế giới, tinh sạch AChE đƣợc thực hiện theo nhiều phƣơng pháp khác nhau [5, 36, 62], AChE đã đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp sắc ký ái lực phối tử ức chế là kháng thể cố định [42, 45, 75] procainamide, tacrine, methylaminophenylamine và những kháng thể đặc hiệu methylacridine [20] từ tế bào sợi ở phổi ngƣời nối với giá thể là Sepharose 6 CNBr-Sepharose [42]. Ngoài ra, AChE cũng đã đƣợc tinh sạch bằng cách giữ lại trên cột ái lực và đẩy ra bằng procainamide, sau đó đƣợc phân tách tiếp bằng sắc ký trao đổi ion [45, 75] (Bảng 3.2)
Bảng 3.2. Một số kết quả nghiên cứu tinh sạch enzyme AChE STT Đối tƣợng tinh sạch Phƣơng pháp tinh sạch Hoạt độ AChE (U/mg) Độ sạch Hiệu suất (%) 1 Màng hồng cầu ngƣời [33] Sắc ký ái lực 9,22 685 23,5
2 Chuột [50, 76] Sắc ký ái lực 2,206 Không xác định
60-92
3 Gan cừu [11] Sắc ký ái lực 21 842 Không xác
định 4 Não Oreochromis aurea [81] Sắc ký ái lực 20,6 139 22,1 5 Pardosa astrigera [52] Sắc ký trao đổi ion và lọc gel 24,11 229,6 13,88 6 Thí nghiệm của nhóm nghiên cứu Sắc ký trao đổi ion và lọc gel 124 13,47 14,4
Ngoài ra, AChE từ cá đuối điện, hồng cầu bò và từ lƣơn đã đƣợc tinh sạch nhờ sự liên kết đặc hiệu với tacrine đã đƣợc tổng hợp trên giá thể epoxy-activated Sepharose 6B [20]. AChE đƣợc tinh sạch với hiệu suất 59% đối với hồng cầu bò, 27-60% đối với cơ quan của cá đuối điện và >92% đối với hai nguồn AChE thƣơng
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
mại từ lƣơn. AChE từ lƣơn có nguồn gốc thƣơng mại bao gồm 2 loại protein với khối lƣợng phân tử là 80 và 55 kDa. Trong khi đó một nguồn AChE thƣơng mại khác từ lƣơn bao gồm 2 protein 55 và 25 kDa. Bên cạnh đó, AChE tinh sạch đƣợc từ bị chỉ có một loại protein có khối lƣợng phân tử là 80kDa.
Nhƣ vậy có thể thấy, bằng các phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch khác nhau thì AChE thu đƣợc từ hồng cầu bò là cao hơn rất nhiều so với các nguồn nguyên liệu khác. Bên cạnh đó hồng cầu bị là loại ngun liệu rẻ tiền, dễ thu mua, thuận lợi để sản xuất AChE trên quy mô lớn.
3.2.3. Kiểm tra độ sạch của chế phẩm acetylcholinesterase từ hồng cầu bò bằng SDS – PAGE. SDS – PAGE.
Độ sạch của chế phẩm sau khi qua bƣớc sắc ký trao đổi ion DEAE - sepharose và sắc ký lọc gel SephadexTM
G-75 đƣợc kiểm tra bằng điện di thể hiện trên hình 3.4.
Hình 3.4. Điện di đồ của các mẫu AChE sau tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion
DEAE - sepharose và gel SephadexTM G75
Chú thích: Đường chạy 1: Dịch lên cột; Đường chạy 2: Dịch chảy qua; Đường chạy 3:
Dịch rửa; Đường chạy 4: Maker; Đường chạy 5, 6: Phân đoạn protein thu được khi đẩy bằng NaCl ≈100mM; Đường chạy 7, 8: Phân đoạn protein thu được khi đẩy bằng NaCl ≈200mM; Đường chạy 9, 10: Phân đoạn protein thu được qua cột lọc gel SephadexTM
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Kết quả kiểm tra độ sạch của chế phẩm sau khi qua bƣớc lọc gel cho thấy dịch chiết thô chứa rất nhiều protein, chế phẩm AChE sau khi qua cột DEAE - sepharose có số băng protein ít đi rất nhiều. Chế phẩm AChE sau khi qua cột lọc gel SephadexTM G75 có một số băng trong đó có băng có kích thƣớc 67 kDa là rõ nét nhất và có thể đây là băng đặc trƣng cho AChE và đã đƣợc tinh sạch.
Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của AChE (Hình 3.4) cũng cho thấy việc sử dụng cột DEAE – Sepharose, SephadexTM G75 để tinh s ạch AChE thu đƣợc hiệu quả khả quan bởi vì h ầu hết các thành phần protein phức tạp đã bị loại bỏ. Trong các phân đoạn tinh sạch, chúng tôi chỉ thu đƣợc một băng protein có kích thƣớc khoảng 67 kDa, tƣơng ứng với kích thƣớc của AChE và có thể khẳng định đã tinh sạch thành công AChE. Kết quả định lƣợng protein từ 100 ml dịch chiết, đã thu đƣợc tổng số 1,26 mg enzyme acetylcholinesterase.
3.2.4. Đông khô chế phẩm enzyme acetylcholinesterase
Các phân đoạn tinh sạch AChE từ hồng cầu bò bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel SephadexTM G75 đƣợc thu lại và đông khô. Sau 24 giờ thu đƣợc các phân đoạn với kết quả nhƣ sau (bảng 3.3).
Bảng 3.3. Kết quả đông khô các phân đoạn protein sau sắc ký trao đổi ion
AChE từ hồng cầu bị
Sản phẩm đơng khơ (g) 0,3046
Hoạt độ riêng (U/mg) 110
Từ kết quả nghiên cứu nêu trên chúng tôi xây dựng đƣợc quy trình tinh sạch AChE từ hồng cầu bị (hình 3.5).
Thuyết minh quy trình: - Bƣớc 1: Xử lý mẫu
1. Máu bò đƣợc lấy trực tiếp từ lò mổ đƣợc bổ sung chất chống máu natri citrate 3,8% (tỉ lệ 1:9) (hoặc cho vào các ống chống đông heparin, EDTA...) và bảo quản lạnh.
2. Máu bò tiếp tục đƣợc ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút, trong 10 phút, ở 4oC để thu nhận các tế bào máu.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
3. Các tế bào máu đƣợc rửa sạch 3 lần bằng dung dịch muối NaCl 0,15% (tỉ lệ 1:5) và ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC.
4. Bổ sung đệm phosphate 0,02M, pH 8,0 (môi trƣờng phù hợp cho enzyme AChE hoạt động) với tỷ lệ thể tích 1:3, trộn đều.
5. Bổ sung enzyme lysozyme với nồng độ cuối là 0,25 mg/ml vào dung dịch đệm đã trộn đều với các tế bào máu và ủ ở 37o
C trong 10 phút để phân giải hoàn toàn màng tế bào và giải phóng enzyme AChE.
6. Ly tâm 12.000 vịng/phút, trong 30 phút, ở 4oC để loại bỏ xác tế bào cùng với các thành phần khác và thu lấy dịch nổi có chứa các protein enzyme AChE.
7. Lọc dịch nổi thu đƣợc qua màng cut-off 0,45 nm.
- Bƣớc 2: Tinh sạch AChE bằng cột trao đổi ion DEAE-Sepharose
1. Nhồi 50 ml gel DEAE-Sepharose (đang bảo quản trong cồn 20%) lên cột kích thƣớc 3,8 x 15 cm (đã đƣợc rửa sạch bằng nƣớc cất và đệm).
2. Cân bằng cột bằng 200 ml đệm phosphate 0,02M, pH 8.
3. Pha loãng 10 lần 50 ml dung dịch mẫu thu đƣợc sau khi xử lý trong đệm phosphate 0,02M, pH 8 và cho lên cột.
4. Thu lại dịch chảy qua cột để kiểm tra và rửa cột bằng 50 ml đệm Phosphate 0,02M, pH 8.
5. Đẩy cột bằng đệm NaCl từ 20 mM -1000 mM, phosphate 0,02M, pH 8, thu mỗi phân đoạn 2 ml và đo A280, đến khi A280<0,05.
6. Xác định hoạt độ AChE, định lƣợng protein của các phân đoạn và kiểm tra bằng phƣơng pháp SDS-PAGE.
7. Dồn các phân đoạn tinh sạch có hoạt độ AChE cao nhất để tiếp tục tinh sạch.
- Bƣớc 3: Tinh sạch AChE bằng cột lọc gel Sephadex G-100
1. Nhồi 50-60 ml gel Sephadex G-75 (đã đƣợc ngâm trƣơng nở trong đệm phosphate 0,02M, pH 8) lên cột kích thƣớc 1 x 80 cm (đã đƣợc rửa sạch bằng nƣớc cất và đệm).
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
5. Thu phân đoạn chảy ra, mỗi phân đoạn 2 ml. Đồng thời bổ sung đệm liên tục để tránh bị khô gel.
6. Xác định hoạt độ AChE, định lƣợng protein của các phân đoạn và kiểm tra bằng phƣơng pháp SDS-PAGE.
7. Dồn các phân đoạn tinh sạch có hoạt độ AChE cao nhất. - Bƣớc 4: Thẩm tích loại muối
- Bƣớc 5: Đông khô
1. Các phân đoạn tinh sạch AChE bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel SephadexTM G75 tiếp tục đƣợc dồn lại vào 3 cốc 150 ml để ở -20oC trong 8h.
2. Tiến hành đông khô, sau 24h thu đƣợc chế phẩm enzyme AChE dạng bột. 3. Kiểm tra hoạt độ AChE và bảo quản mẫu ở -20oC.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 3.5. Quy trình tinh sạch enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bị 3.3. Nghiên cứu một số tính chất enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò
Sau khi đã thu đƣợc AChE tinh sạch, chúng tơi tiến hành nghiên cứu tính chất của AChE trong một số điều kiện pH, nhiệt độ... khác nhau với mục đích nhằm tối ƣu mơi trƣờng phản ứng và điều kiện bảo quản của enzyme này.
3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme acetylcholinesterase
Để xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính AChE, tiến hành thí nghiệm tại các điều kiện nhiệt độ khác nhau (từ 20oC đến 70oC) theo các bậc thay đổi nhiệt độ là 5oC trong 30 phút. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính của AChE đƣợc thể hiện trong hình 3.6.
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme AChE
Tốc độ phản ứng cũng nhƣ hoạt độ enzyme phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ phản ứng. Kết quả hình 3.6 cho thấy ở nhiệt độ thấp (10oC - 25oC) nếu nhiệt độ của phản ứng tăng thì hoạt độ của enzyme cũng tăng, ngƣợc lại từ 45oC trở đi nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì hoạt độ enzyme bị giảm dần và mất hẳn hoạt tính ở 75o
C. Khoảng nhiệt độ thích hợp nhất đối với phản ứng thủy phân sử dụng xúc tác AChE là 30o
C - 40oC do AChE tinh sạch đƣợc có nguồn gốc từ bị - là động vật đẳng nhiệt với thân nhiệt ổn định trong khoảng 30 - 40o
C.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của AChE đƣợc thể hiện ở hình 3.7
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của enzyme AChE
Kết quả thu đƣợc cho thấy AChE từ bị có hoạt tính cao nhất trong khoảng pH 7 - 7,5, thấp nhất ở pH 4,5, giảm dần từ pH 8.
Từ các kết quả trên có thể thấy AChE từ bị có nhiệt độ và pH hoạt động tối thích tƣơng tự nhƣ AChE từ màng hồng cầu ngƣời với nhiệt độ tối ƣu 25 - 35o
C, pH tối ƣu 7,4 [33]. Tuy nhiên AChE bò hoạt động tốt nhất ở điều kiện khác với AChE của cá, AChE ở não cá Colosoma macropomum có nhiệt độ tối ƣu 45oC, pH 7 - 8 [12] cịn AChE ở hồng cầu cá Lake Van có nhiệt độ tối ƣu 250C, pH 8 [6].
3.4. Nhân dịng và giải trình tự gen mã hóa AChE từ hồng cầu bị
3.4.1. Tách chiết RNA tổng số từ máu bò và tổng hợp cDNA
Để nhân bản đoạn gen mã hóa AChE từ hồng cầu bị, đầu tơi chúng tơi đã tiến hành tách chiết RNA tổng số từ máu bò bằng bộ kit của hãng Bio-Rad. Kết quả đo quang phổ của mẫu RNA ở bƣớc sóng 230 nm là 10,7 ng/µl. RNA tổng số tiếp tục đƣợc sử dụng để tổng hợp cDNA bằng enzyme phiên mã ngƣợc M-MLV Reverse Transcriptase của hãng Enzynomics và mồi hexamer. cDNA thu đƣợc sẽ đƣợc sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Sau khi đã tách chiết thành công RNA tổng số từ máu bò và tổng hợp đƣợc cDNA, đoạn gen AChE đƣợc nhân bản dựa trên cDNA đã tổng hợp