CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Nhân dòng và giải trình tự gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò
3.4.1. Tách chiết RNA tổng số từ máu bò và tổng hợp cDNA
Để nhân bản đoạn gen mã hóa AChE từ hồng cầu bị, đầu tơi chúng tơi đã tiến hành tách chiết RNA tổng số từ máu bò bằng bộ kit của hãng Bio-Rad. Kết quả đo quang phổ của mẫu RNA ở bƣớc sóng 230 nm là 10,7 ng/µl. RNA tổng số tiếp tục đƣợc sử dụng để tổng hợp cDNA bằng enzyme phiên mã ngƣợc M-MLV Reverse Transcriptase của hãng Enzynomics và mồi hexamer. cDNA thu đƣợc sẽ đƣợc sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Sau khi đã tách chiết thành công RNA tổng số từ máu bò và tổng hợp đƣợc cDNA, đoạn gen AChE đƣợc nhân bản dựa trên cDNA đã tổng hợp đƣợc bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế dựa trên
trình tự gen AChE của bò đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen thế giới
(NM_001076220.1).
Sau khi PCR và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% , chúng tơi thu đƣợc 1 băng DNA có kích thƣớc khoảng 1,8 kb. Trong khi đó, mẫu đối chứng âm (khơng có khn DNA) thì khơng xuất hiện băng nào (hình 3.8). Kích thƣớc đoạn gen thu đƣợc tƣơng đƣơng với kích thƣớc của đoạn gen
AChE (NM_001076220.1) đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen thế giới.
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen AChE từ máu bị
Chú thích: 1: Thang chuẩn DNA 1 kb; 2: Mẫu đối chứng (-), khơng có DNA; 3: Sản phẩm PCR của mẫu cDNA tổng hợp từ RNA tổng số tách từ máu bò
Kết quả này cho phép chúng tôi bƣớc đầu khẳng định đã nhân bản thành cơng đoạn gen mã hóa cho AChE từ hồng cầu bị.
3.4.3. Nhân dịng gen mã hóa AChE từ hồng cầu bị vào vector pGEM T
Sau khi nhân bản đoạn gen mã hóa AChE có kích thƣớc khoảng 1,8 kb bằng phƣơng pháp RT-PCR và kiểm tra sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%, chúng tôi đã tiến hành gắn trực tiếp đoạn gen này vào vector
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
pGEMT bằng bộ kit của hãng Promega (Đức). Thành phần của phản ứng ligase đƣợc trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng ligase AChE vào vector pGEM T
Thành phần phản ứng Phản ứng chuẩn Đối chứng dƣơng Đối chứng âm
2X Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase 5 µl 5 µl 5 µl
Vector pGEM T (50ng) 1 µl 1 µl 1 µl Sản phẩm PCR 1 µl - - DNA chèn đối chứng - 2 µl - T4 DNA Ligase 1 µl 1 µl 1 µl H2O 2 µl 1 µl 3 µl Tổng thể tích 10 µl 10 µl 10 µl
Hỗn hợp phản ứng ligase đƣợc để 24h ở 4oC, sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α. Kết quả biến nạp thu nhận đƣợc hầu hết các khuẩn lạc trắng và một số khuẩn lạc xanh trên môi trƣờng LB có bổ sung kháng sinh ampicillin 50 g/ml, với sự cảm ứng của IPTG (1 mM) và cơ chất X-gal (hình 3.9).
Chọn ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc trắng để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen nhân dòng bằng phƣơng pháp PCR sử dụng cặp mồi pGEM.Fw và pGEM.Rv đƣợc thiết kế đặc hiệu cho vector pGEMT. Theo tính tốn lý thuyết, nếu vector có mang đoạn gen AChE thì sản phẩm PCR thu đƣợc sẽ có kích thƣớc khoảng 2,1kb, bao
gồm kích thƣớc của đoạn gen AChE khoảng 1,8 kb cộng với kích thƣớc đoạn DNA nằm giữa 2 mồi trên vector pGEMT là 0,3 kb.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 3.9. Sự hình thành các khuẩn lạc sau khi biến nạp hỗn hợp gắn đoạn gen mã
hóa AChE và vector pGEMT vào E. coli chủng DH5α
Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm PCR sử dụng DNA từ 3 khuẩn lạc trắng làm khn (hình 3.10) cho thấy các sản phẩm PCR từ khuẩn lạc trắng đều cho băng DNA có kích thƣớc khoảng 2,1 kb (các đƣờng chạy 3-5).
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc kiểm tra vector pGEM-AChE
Chú thích 1: Thang chuẩn DNA 1kb; 2: Đối chứng âm; 3- 5: Khuẩn lạc PCR với mồi pGEM Fw/Rv; 6- 8: Khuẩn lạc PCR với mồi AChE Fw/Rv
Khi PCR khuẩn lạc trắng với cặp mồi đặc hiệu AChE Fw/Rv thu đƣợc sản phẩm cho băng DNA kích thƣớc kho ảng 1,8 kb tƣơng đƣơng với kích thƣớc AChE (đƣờng chạy 6-8). Nhƣ vậy, đã thu đƣợc các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp vector pGEM có chứa đoạn gen nhân bản có kích thƣớc khoảng 1,8 kb đặc hiệu cho
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
AChE. Vì vậy, có thể kết luận đã nhân dịng thành cơng đoạn gen mã hóa AChE vào
vector pGEMT.
Những khuẩn lạc trắng này đƣợc nuôi lắc trong 5-10 ml LB lỏng, bổ sung kháng sinh ampicillin với nồng độ 50 µg/ml, ở 37o
C trong 12h để tách plasmid. Plasmid pGEM-AChE tinh sạch sẽ đƣợc thu nhận bằng 50 µl EB. Sau khi tách đƣợc plasmid tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1% (hình 3.11).
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm plasmid pGEM- AChE
Chú thích: 1‟: Thang chuẩn ADN 1kb; 2‟: Plasmid pGEM- AChE
Kết quả diện di cho thấy đã tách đƣợc plasmid có kích thƣớc khoảng 4,8 kb, tƣơng ứng với kích thƣớc của vector tái tổ hợp pGEM- AChE. Để khẳng định
chắc chắn, tiến hành PCR kiểm tra plasmid tách đƣợc bằng cặp 2 mồi đặc hiệu của vector pGEM T và của đoạn gen AChE. Kết quả kiểm tra đƣợc thể hiện ở hình 3.12
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 3.12. Kết quả PCR kiểm tra plasmid pGEM- AChE
Chú thích:1: Thang chuẩn DNA 1kb; 2: Đối chứng âm; 3: Plasmid pGEM- AChE với mồi pGEM Fw/Rv; 4: Plasmid pGEM- AChE với mồi AChE Fw/Rv
Vector tái tổ hợp đƣợc ký hiệu là pGEM- AChE và đƣợc tách ra ở dạng tinh sạch để cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.4. Giải trình tự của gen mã hóa AChE từ hồng cầu bị
Để biết chính xác trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa cho AChE, tiến hành giải trình tự đoạn gen này trong vector pGEM-AChE thu đƣợc, tách plasmid từ các khuẩn lạc trắng và tiến hành xác định trình tự các đoạn gen mã hóa AChE. Kết quả phân tích trình tự nucleotide của gen AChE thu đƣợc trong nghiên cứu đƣợc so sánh với trình tự AChE của bị đã đƣợc cơng bố trên ngân hàng Gen
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 3.13. So sánh trình tự gen AChE trong nghiên cứu và trình tự AChE của bị đã
đƣợc công bố trên thế giới (NM_001076220.1)
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Từ hình 3.13 cho thấy, trình tự AChE thu đƣợc trong nghiên cứu có sự tƣơng đồng 100% so với trình tự AChE của bị đã đƣợc cơng bố trên thế giới. Dựa vào kết quả phân tích bằng phần mềm ApE (hình 3.14), trên trình tự gen AChE của hồng cầu bị ở Việt Nam khơng có vị trí cắt của các enzyme giới hạn là HindIII, BamHI, EcoRI, NdeI, XhoI...Trình tự gen mã hóa cho enzyme AChE có nguồn gốc
từ loài ruồi mắt đỏ D.melanogaster đã đƣợc nhân dòng và biểu hiện thành trong vector pYes-DEST52. Trong đó, nhóm nghiên cứu đã sử dụng các enzyme giới hạn
NdeI, XhoI, SmBI, BglII và NotI đều là những enzyme khơng có vị trí cắt trên trình
tự gen AChE của hồng cầu bị. Vì vậy, việc lựa chọn thiết kế cặp mồi PCR để thêm trình tự nhận biết của hai enzyme NdeI vào đầu 5' và EcoRI đầu 3' của gen mã hóa AChE là hồn tồn phù hợp để sản xuất bằng phƣơng pháp tái tổ hợp.
Trình tự các acid amin của protein AChE cũng đã đƣợc nghiên cứu và công bố trên cơ sở dữ liệu về trình tự của protein UniProt. Qua đó, cho thấy rằng AChE của bị là một chuỗi gồm 610 acid amin, có 3 vị trí hoạt động (hình 3.15), 4 vị trí glycosyl hóa và 4 vị trí cầu nối disunfua (hình 3.16). Chuỗi peptide tín hiệu gồm các acid amin từ vị trí 1-30.
Hình 3.15. Các vị trí glycosyl hóa và vị trí hình thành cầu nối disunfua của AChE
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 3.16. Trình tự acid amin enzyme AChE của bị với các vị trí trung tâm hoạt
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 3.17. Trình tự acid amin enzyme AChE của ngƣời với các vị trí trung tâm
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
Hình 3.18. So sánh trình tự gen AChE của bị trong nghiên cứu và trình tự AChE của
ngƣời đã đƣợc cơng bố trên thế giới (M55040.1)
Trình tự các axit amin của protein AChE ở ngƣời cũng đã đƣợc nghiên cứu và công bố trên cơ sở dữ liệu về trình tự của protein UniProt. So sánh trình tự acid amin AChE của ngƣời và bị cho thấy, AChE của ngƣời có các axit amin ở trung tâm hoạt động (active site) và các subsite – quyết định tính đặc hiệu và hoạt động của enzyme - trùng với AChE của bò (Hình 3.17). Trình tự gen AchE bị thu đƣợc trong nghiên cứu có sự tƣơng đồng 91% so với trình tự gen AChE của ngƣời đã đƣợc cơng bố trên thế giới (hình 3.18). Bên cạnh đó, AChE của ngƣời đã đƣợc nhân dịng và biểu hiện thành cơng trong E.coli [28]. Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất AChE của bò bằng con đƣờng tái tổ hợp, biến nạp vào E.coli là hoàn toàn khả thi.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
KẾT LUẬN
Với những kết quả thu đƣợc trong q trình nghiên cứu nhƣ trên, chúng tơi đƣa ra một số kết luận sau:
1. Đã nghiên cứu xác định đƣợc hoạt độ enzyme Acetylcholinesterase trong máu của 04 sinh vật (bò, lợn, ngan và gà). Kết quả cho thấy hoạt độ AChE của các sinh vật tƣơng đối thấp (AChE < 0,05 U/mg nguyên liệu tƣơi). Trong đó, hoạt độ của AChE trong bò là cao nhất đạt 0,024 U/mg nguyên liệu tƣơi.
2. Đã tinh sạch thành công enzyme AChE từ hồng cầu bò bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel. Chế phẩm AChE thu đƣợc ở phân đoạn cao nhất là 148 U/mg.
3. Đã thu đƣợc 304,6 mg AChE dạng đơng khơ từ hồng cầu bị có hoạt độ riêng là 110 U/mg. Chế phẩm AChE hoạt động tối thích ở pH khoảng 7-8 , nhiệt độ tối ƣu trong khoảng 30-40oC.
4. Đã nhân bản thành cơng đoạn gen mã hóa cho AChE, đoạn gen có kích thƣớc khoảng 1,8 kb từ hồng cầu bị bằng phƣơng pháp RT-PCR. Đồng thời nhân dịng thành cơng đoạn gen này vào vector pGEM T.
5. Trình tự đoạn gen mã hóa cho AChE từ hồng cầu bị ở Việt Nam tƣơng đồng 100% so với trình tự gen AChE đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen thế giới (NM_001076220.1). Trình tự này khơng có vị trí cắt của các enzyme giới hạn là HindIII, BamHI, EcoRI, NdeI, XhoI.... và đã đƣợc thiết kế thêm trình
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu để tối ƣu hóa điều kiện tinh sạch nhằm tăng hoạt độ của enzyme acetylcholinesterase.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Đinh Ngọc Tấn, (1998), Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện nâng cao hoạt độ
enzyme cholinesterase tách từ nguồn nguyên liệu trong nước và ứng dụng phân tích chất độc cơ photpho, Luận án tiến sĩ hóa học.
2. Lê Minh Trí, (2005), Nghiên cứu khai thác và ứng dụng enzyme acetylcholinesterase chẩn đoán chất độc phospho hữu cơ, Luận văn thạc sỹ khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.
3. Lê Minh Trí, (2010), Nghiên cứu tinh sạch, tính chất đặc trưng và ứng dụng
của acetylcholinesterase từ ốc bươu vàng, Luận án tiến sĩ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.
Tiếng Anh
4. A. Singh, Sunil K. Jaiswal and B. Sharma. (2013), "Effect of low temperature stress on acetylcholinesterase activity and its kinetics in 5th instar larvae of Philosamia ricini", Journal of Biochemistry Research, Vol.
1(2), p. 17-25.
5. Ahmed M., Latif N., Khan R.A., Ahmad A., Rocha J.B.T., Mazzanti C.M., Bagatini M.D., Morsch V.M., Schetinger M.R.C. (2012), "Enzymatic and biochemical characterization of Bungarus sindanus snake venom acetylcholinesterase", The Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, Vol. 18, pp. 236-243.
6. Aliriz S., Turkoglu V. (2003), “Purification and characterization of acetylcholinesterase from the Lake Van fish (Chalcalburnus tarichii Pallas, 1811), Prep Biochem Biotechnol, Vol. 33(2), pp. 137-45.
7. Anderson R. B., and Key, B.,. (1999), "Role of acetylcholinesterase in the development of axon tracts within the embryonic vertebrate brain", Int. J. Dev. Neurosci, Vol. 17, pp. 787-793.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
8. Andrade M.T., Lima J.A., Pinto A.C., Rezende C.M., Carvalho M.P. and Epifanio R. De A. (2005), Indole alkaloids from Taberneamontana australis (Muell. Arg.) Miers that inhibit acetycholinesterase enzyme, Bioorg,
Medicinal Chemistry, Vol. 13.
9. Arpagaus M., Kott M., Vatsis K. P, Bartels Cynthia F., La Du Bert N., Lockridge O. (1990), “Structure of the gene for human butyrylcholinesterase. Evidence for a single copy”, Biochemistry, Vol. 29(1), pp. 124-31.
10. Arrieta D.E., McCurdy S.A., Henderson J.D., Lefkowitz L.J., Reitstetter R., Wilson B.W. (2009), “Normal range of human red blood cell acetylcholinesterase activity”, Drug and Chemical Toxicology, Vol. 32, pp. 182 – 185.
11. Askar K.A., Kudi A.C. & Moody A.J. (2011), “Purification of soluble acetylcholinesterase from sheep liver by affinity chromatography”, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 165, pp. 336–346.
12. Assis C.R., Castro P.F., Amaral I.P., Carvalho E.V., Carvalho L.B., Bezerra R.S. (2010), “Characterization of acetylcholinesterase from the brain of the Amazonian tambaqui (Colossoma macropomum) and in vitro effect of organophosphorus and carbamate pesticides”, Environmental Toxicology and
Chemistry, Vol. 29(10), pp. 2243-8.
13. Augustinsson K.B. (1948), “Cholinesterases, a study in comparative enzymology”, Acta Physiologica Scandinavica, Vol. 15(Suppl 52), pp. 1–
182.
14. Augustinsson K.B. (1959a), “Electrophoresis studies on blood plasma esterases: I. Mammalian plasmata”, Acta Physiologica Scandinavica, Vol.
13, pp. 571–592.
15. Augustinsson K.B. (1959b), “Electrophoresis studies on blood plasma esterases: II. Avian, reptilian, amphibian and piscine plasmata”, Acta Physiologica Scandinavica, Vol. 13, pp. 1081–1096.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
16. Bany I.A., Dong M.Q., Koelle M.R. (2003), “Genetic and cellular basic for acetylcholine inhibition”, The Journal of Neuroscience, Vol. 23, pp. 8060-
8069.
17. Barbosa Filho J.M., Karina C., Paula Medieros, Margareth de Fátima F.M. Diniz, Leônia M. Batista. Petrônio F. Athayde-Filho, Marcelo S. Silva, Emídio V.L. da-Cunha, Jackson R.G. Silva Almeida, Lucindo J. Quitans- Júnior (2006), Natural products inhibitors of the enzyme acetylcholinesterase, Revista Brasileira de Famacognosia, Vol. 16, pp. 258- 285.
18. Bartels C.F., Xie W., MillerLindholm A. K., Schopfer L. M., and Lockridge O. (2000), “Determination of the DNA sequences of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase from cat and demonstration of the existence of both in cat plasma”, Biochemical Pharmacol, Vol. 60(4), pp. 479–487. 19. Bon S., Huet M., Lemonnier M., Rieger F., Masssoulie J. (1976), “Molecular
forms of Electrophorus acetylcholinesterase, molecular weight and composition", European Journal of Chemistry, Vol. 68, pp. 523 – 530.
20. Carroll R.T. Grimm J.L., Hepburn T.W. & Emmerling M.R. (1995), “Purification of acetylcholinesterase by tacrin affinity chromatography”,
Protein Expression and Purification, Vol. 6 pp. 389–393.
21. Chen J.W., Ling K.H. (1996), “Territrems, naturally occurring specific irreversible inhibitors of acetylcholinesterase”, Journal of Biomedical Science, Vol. 3, pp. 54–58.
22. Chiappa S., Brimijoin S. (1998), "Pharmacologic tests of a role for acetylcholinesterase in promoting neurite outgrowth by dorsal root ganglia",
Structure and Function of Cholinesterases and Related Proteins, pp. 585–
592.
23. Culetto E., Combes D., Fedon Y., Roig A., Toutant J. P., and Arpagaus M. (1999), “Structure and promoter activity of the 5' flanking region of ace1, the gene encoding acetylcholinesterase of class A in Caenorhabditis elegans”, Journal of Molecular Biology, Vol. 290, pp. 951–966.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang
24. Dale H. H. (1914), "The action of certain esters and ethers of choline and their relation to muscarine", Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol. 6, pp. 147-190.
25. Daniel, Kelly et al. (2008), “Computational studies on the solvolysis of the chemical warfare agent VX”, Journal of Physical Organic Chemistry, Vol.
21, pp. 321-328.
26. De La Hoz D., Doctor B. P., Ralston J. S., Rush R. S., and Wolfe A. D