Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4. MỘT SỐ LOẠI CHỈ THỊ PHÂN TỬ THƢỜNG ĐƢỢC SỬ DỤNG TRONG
1.4.1.2. Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN
Phản ứng chuỗi trùng hợp hay kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis đƣa ra, giúp phát hiện sự đa hình ADN dựa trên cơ sở nhân bản các đoạn ADN với số lƣợng lớn dựa trên nguyên lí tái bản của ADN trong tự nhiên.
Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs – Đa hình các đoạn ADN nhân bản ngẫu nhiên)
Chỉ thị RAPD hay còn gọi là RAPD – PCR đƣợc hình thành dựa trên nguyên lý của kỹ thuật PCR đƣợc William và ctv phát triển vào năm 1990. Trong chỉ thị RAPD không cần dùng cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn ADN nhất định mà dùng các mồi đơn ngẫu nhiên để nhân các đoạn ADN một cách ngẫu nhiên. Mồi ngẫu nhiên là đoạn oligonucleotide dài khoảng từ 6 – 12 nucleotide, nhiệt độ kết cặp thấp. Do tính ngẫu nhiên nên các đoạn mồi này vừa là mồi xuôi, vừa là mồi ngƣợc. Các đoạn này sẽ bắt cặp với trình tự bổ sung trong hệ gen của sinh vật để nhân bản. Sự đa hình phát hiện đƣợc khi sử dụng kỹ thuật RAPD có thể là do sự thay đổi bazơ nucleotide ở vị trí gắn mồi, hoặc sự thêm hay mất nucleotide nằm trong vùng nhân bản. (Williams J.G, et al (1990)[91]
Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài các đoạn ADN nhân bản chọn lọc)
Chỉ thị AFLP dựa trên nguyên tắc sử dụng enzym giới hạn và PCR (Vos và ctv, 1995). Để thiết kế đƣợc các mồi đặc trƣng trƣớc hết cắt các mẫu nghiên cứu bằng enzym giới hạn. Khi xử lý enzym giới hạn ADN sẽ bị cắt thành vơ số mảnh có kích thƣớc khác nhau. Mỗi mảnh cắt, đều biết trƣớc trình tự nucleotide của chúng ở hai đầu cắt. Dựa vào trình tự ở hai đầu cắt thiết kế các đoạn gắn (adaptor). Sau đó dùng enzym ligase để nối các đoạn ADN thích ứng vào hai đầu ADN đã cắt. Dựa vào trình tự adaptor ta thiết kế mồi PCR. Mồi PCR gồm hai phần: Một phần có trình tự bổ sung với adaptor và phần kia là những nucleotide đƣợc thêm vào tùy ý, thƣờng từ 1 – 3 nucleotide. Với mồi thiết kế nhƣ vậy thì chỉ có những đoạn ADN có trình tự ở hai đầu bổ sung với trình tự mồi mới đƣợc nhân bản.
Ƣu điểm của phƣơng pháp này là lƣợng ADN sử dụng cho nghiên cứu ít, băng ADN ổn định, khả năng ứng dụng rộng rãi và do có thể bổ sung các nucleotide khác nhau khi thiết kế mồi nên số lƣợng mồi có thể thiết kế đƣợc và tiềm năng ứng dụng rất lớn. AFLP cịn cung cấp một lƣợng đa hình ADN lý tƣởng từ ADN của bất kỳ nguồn gốc nào từ đơn giản đến phức tạp. AFLP cũng đƣợc coi là công cụ hiệu quả nghiên cứu tính đa hình di truyền, tìm chỉ thị liên kết, xây dựng bản đồ di truyền mật độ cao. Đặc biệt đƣợc dùng trong phân tích ADN từ nhiều nguồn gốc với mức độ phức tạp khác nhau.
Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site – Vị trí trình tự được đánh dấu)
Chỉ thị STS do M. Olson và cộng sự đề xuất năm 1989. STS là một đoạn ADN ngắn gồm khoảng 60- 1000bp có thể đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật PCR. Nó cho phép xác định những vị trí đƣợc đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleotide đã biết trƣớc của ADN trong hệ gen.
STS là chỉ thị nhân bản trực tiếp những locus đã biết bằng việc sử dụng cặp mồi PCR đƣợc thiết kế, theo trình tự đoạn đầu và đoạn cuối của những locus đặc trƣng này. (Trịnh Đình Đạt, 2006)[9] Các đoạn mồi STS chứa khoảng 20 nucleotide
nên có tính đặc hiệu cao với PCR. Mỗi một STS đƣợc xác định tại một điểm trên bản đồ nhƣ là một mốc trong hệ gen. Ở cây lúa, các STS đƣợc coi nhƣ là mốc chuẩn và ngƣời ta đã xác lập đƣợc các STS liên kết với một số gen kháng sâu bệnh, sử dụng để phát hiện tính đa hình xây dựng bản đồ di truyền liên kết nhƣ STS liên kết với gen chống chịu với điều kiện bất lợi ở lúa. (Lê Duy Thành, 2000)[23]. Nhờ đó việc tìm kiếm các gen kiểm soát hoặc liên quan chặt chẽ đến một tính trạng di truyền nào đó có thể đƣợc tiến hành dễ dàng. Sử dụng trong lĩnh vực chọn giống dựa vào các dấu phân tử STS để tìm kiếm các gen quan tâm trong quần thể và phân tích nguồn gen, nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các loài.
Chỉ thị RGA (Resistance Gene Analog – Vùng tương đồng gen kháng)
Khi so sánh trình tự ADN của những gen kháng đã phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau, các nhà khoa học đã thấy rằng những gen này có chung những vùng lặp lại, nhƣ vùng lặp lại giàu leucin (Leucine Rich Repeat: LRR), vùng vị trí liên kết nucleotide (Nucleotide Binding Site: NBS) và vùng protein Kinaza (PK) (Grant và ctv., 1995[43]. Bản chất của kỹ thuật RGA là những cặp mồi ADN đƣợc xây dựng dựa vào những vùng bảo tồn nằm trong gen kháng. Bởi vậy, sản phẩm ―nhận dạng‖ ADN có thể là một vùng hoặc tồn bộ gen kháng. Kỹ thuật RGA đã đƣợc dùng để tách, lập bản đồ gen kháng và phân tích đa dạng di truyền. (Chen và ctv., 1999)[32]. Những mồi RGA đã sử dụng cũng tách biệt những giống lúa có hệ gen di truyền
Indica từ hệ gen di truyền japonica. Ngoài ra, mối liên kết giữa chỉ thị RGA với gen
kháng bệnh rỉ sắt cũng đƣợc phát hiện (Chen X. M., Line R. F., Leung H, 1998)[33]
Chỉ thị SNPs (Single nucleotide polymorphism - Đa hình của các nucleotide đơn)
SNP là những biến dạng của chuỗi trình tự ADN đƣợc tìm thấy với tần suất cao nhất trong hệ gen ngƣời. Theo phân tích chi tiết chuỗi trình tự của những phần nào đó trong hệ gen, ADN từ hai cá thể khác nhau phần lớn đều giống nhau với số cặp base khác biệt nhau nằm ở trong khoảng cho phép 500-1000bp. Một cặp base ở
một vị trí nào đó sẽ biểu thị sự khác nhau của cá thể có tính chất phổ biến, và một cặp base khác là biến dị, ít phổ biến hơn ở cùng một vị trí. Nếu cặp base ít phổ biến hơn xuất hiện nhỏ hơn 1% trong quần thể, ngƣời ta gọi vị trí cặp base đó là một SNP. Hiện nay, ngƣời ta đã công bố 3 triệu SNP trong hệ gen ngƣời, nhiều hơn bất cứ chỉ thị phân tử nào đã đƣợc cơng bố trƣớc đó. Chỉ thị SNP đƣợc áp dụng vào đầu những năm 2000, từ hệ gen ngƣời cho đến hệ gen các sinh vật khác nhƣ cây
Arabidopsis, cây lúa (Oryza sativa).