Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp lai hữu tín h lai trở lại giữa giống cho và nhận
gen thông qua phƣơng pháp PCR đối với các chỉ thị phân bố trên 12 NST lúa.
- Điện di trên gel agarose 0,8% nhuộm Ethidium Bromide. - Điện di trên gel polyacrylamide biến tính 4,5% nhuộm bạc.
- Điện di trên gel polyacrylamide khơng biến tính 6% nhuộm Syber safe. - Phân tích dữ liệu trên chƣơng trình Graphical Genotyper (Van Berloo, 2008)[89].
2.2.1. Phƣơng pháp lai hữu tính - lai trở lại giữa giống cho và nhận gen chịu ngập ngập
AS996 đƣợc chọn làm cây mẹ và IR64Sub1 đƣợc chọn làm cây bố để lai tạo con lai F1, sử dụng phƣơng pháp lai hữu tính (thụ phấn bằng tay). Hoa lúa chƣa tung phấn của cây AS996 đƣợc khử đực bằng cách cắt bỏ 6 bao phấn của mỗi hoa, sau đó lấy hạt phấn của cây IR64Sub1 thụ phấn cho cây AS996. Sau 30 ngày thu hạt lai F1.
Các hạt lai F1 đƣợc trồng đến khi đƣợc 20 ngày tuổi thì tiến hành tách chiết ADN, kiểm tra sự có mặt của gen chịu ngập bằng chỉ thị phân tử. Chọn lọc các cá thể dị hợp tử mang gen chịu ngập để lai trở lại với giống AS996 (làm bố) tạo quần thể BC1F1. Các cá thể BC1F1 đƣợc trồng, tách chiết ADN, kiểm tra sự có mặt của gen chịu ngập và chọn lọc nền gen của cây mẹ bằng chỉ thị phân tử. Chọn những cá thể mang gen chịu ngập và có nền di truyền lớn nhất của giống AS996 để lai trở lại với dòng nhận gen tạo BC2F1.
Tiếp tục các công việc nhƣ từ thế hệ BC1F1 đến thế hệ BC3F1 có thể lai thêm 1 thế hệ nữa hoặc cho tự thụ để chọn cá thể đồng hợp tử mang gen kháng, chọn đƣợc dòng mang gen chịu ngập chìm và mang phần trăm lớn nhất nền gen của cây mẹ