CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.4. Thế dẫn xuất halogenua bằng xianua
Phản ứng chuyển hóa alcohol no thành dẫn xuất iodua khi cho tác dụng với I2 trong sự có mặt của PPh3 và imidazole.
Phản ứng Appel nhằm chuyển hóa alcohol thành dẫn xuất halogenua [35-38]. Cơ chế phản ứng đi qua các bước: sự halogen hóa triphenyl phosphine sau đó tạo alkoxide với alcohol. Phản ứng thế nucleophile đi theo cơ chế SN2 với sự tấn công của I- vào alkoxide tạo thành dẫn xuất halogenua, với sản phẩm phụ là triphenyl phosphine oxide PPh3=O.
2.3.4. Thế dẫn xuất halogenua bằng xianua Sơ đồ chung của phản ứng: Sơ đồ chung của phản ứng:
Phản ứng thế theo cơ chế SN2. Phản ứng này nhằm mục đích làm tăng 1C so với chất ban đầu. Từ dẫn xuất nitrile này ta có thể tiến hành nhiều phản ứng thứ cấp khác như thủy phân để thành acid carboxylic hoặc ester có nhiều hơn ít nhất 1C so với dẫn xuất iodua ban đầu [39].
Chuyển hóa nitrile thành acid carboxylic [39-41] Sơ đồ phản ứng chung:
Tùy thuộc vào điều kiện phản ứng (mơi trường acid/base) mà ta có các cơ chế phản ứng khác nhau.
Môi trường base:
Thủy phân nitrile trong môi trường kiềm (NaOH hoặc KOH) được tiến hành trong dung môi EtOH, đun hồi lưu. Cơ chế phản ứng như sau:
Môi trường acid:
Thủy phân trong môi trường acid thường được thực hiện trong môi trường acid mạnh và đun hồi lưu.
Chuyển hóa nitrile thành ester
Phản ứng cịn có tên gọi phản ứng Pinner, chuyển nitrile thành ester. Acol hay sử dụng cho phản ứng này là MeOH hoặc EtOH. Sơ đồ chung của phản ứng như sau:
2.3.5. Tổng hợp β-amino acid từ α-amino acid
Dựa vào các lí thuyết đã tóm tắt ở các mục trên chúng tơi đề xuất sơ đồ tổng hợp β-amino acid từ α-amino acid.
Hình 2.19: Sơ đồ tổng hợp β-amino acid từ α-amino acid.
2.3.6. Tổng hợp các mảnh peptide
Sau khi tổng hợp được các β-amino acid, tiến hành tổng hợp các mảnh peptide theo như mong muốn. Để tạo thành liên kết –CO-NH- giữa hai gốc β-amino acid thì cách thơng dụng nhất là thực hiện một chuỗi tổng hợp như sau:
Khóa nhóm amino bằng các nhóm bảo vệ.
Hoạt hóa nhóm carboxyl.
Ghép sản phẩm được hoạt hóa thu được với một amino acid khác.
Gỡ các nhóm bảo vệ.
Do đó, việc lựa chọn β-amino acid làm “đầu N” hay “đầu C” thì sẽ quyết định thời điểm gỡ các nhóm bảo vệ tương ứng.
Tác nhân DCC (Dicyclohexyl carbonidiimide)
DCC là một trong những tác nhân phổ biến trong tổng hợp hữu cơ [42], đặc biệt là sử dụng trong việc tổng hợp peptide từ 1955 trong các nghiên cứu của Sheehan và Hess, tiếp tục được dùng rộng rãi trong các nghiên cứu của Barany và
Cấu trúc của DCC: Tính chất vật lý:
Khơng tan trong nước nhưng tan trong dung môi DMF, DCM, THF, CH3CN.
Chất rắn dạng sáp, thường khó lấy ra khỏi lọ bảo quản.
Hơi độc. Nên khi làm việc với DCC cần được tiến hành trong tủ hút.
Dưới đây là sơ đồ tổng hợp liên kết peptide với tác nhân DCC, qua sơ đồ này có thể thấy ngồi vai trị là chất tạo liên kết peptide thì DCC có thêm vai trị hoạt hóa nhóm carboxyl của acid [42]. Sản phẩm phụ của q trình là dicyclohexyl urea (DCU) khơng tan trong nước và rất khó bị loại bỏ bằng sắc ký cột.
Hình 2.20: Sơ đồ hình thành liên kết peptide khi sử dụng tác nhân DCC
Tác nhân carbodiimide cải tiến EDCI.HCl hay EDC
Một dẫn xuất carbodiimide được cải tiến là N-(3-dimethylaminopropyl)-N’- ethylcarbodiimide [43], được dùng dưới dạng muối hydrochloride nên thường được viết tắt là EDCI.HCl hoặc EDC. Đây cũng là một tác nhân hoạt hóa nhóm carboxyl để ghép với các nhóm amine để tạo ra liên kết peptide.
Cấu trúc của EDC:
Chất trung gian O-Acylisourea
Liên kết amide amin
Với EDC thì hệ sau phản ứng tác dụng với dung dịch HCl sẽ chuyển thành muối ammonium dễ tan. Bản thân nhóm EDC với nhóm amine cũng phân cực hơn DCU nên được giữ lại trên silicagel tốt hơn, nên việc tinh chế sản phẩm khi sử dụng EDC sẽ dễ hơn khi sử dụng DCC [43].
Chất bổ trợ HOBt
Chất bổ trợ HOBt đều được sử dụng cùng với các tác nhân DCC hoặc EDC nhằm thúc đẩy khả năng hoạt động của các tác nhân và làm giảm khả năng hình thành các epimer cũng như N-acylurea là các sản phẩm phụ không mong muốn [44].
HOBt là tên viết tắt của 1-Hydroxybenzotriazole, có cơng thức cấu tạo như
sau:
HOBt được phát triển bởi W.Konig và R.Geiger vào năm 1970, đây là chất bổ trợ được sử dụng cho đến ngày nay. Đồng thời HOBt cịn có hạn chế khả năng raxemic hóa sản phẩm thu được khi sử dụng các tác nhân carbodiimide.
Hình 2.21: Cơ chế phản ứng giữa HOBt và sản phẩm trung gian khi sử dụng DCC
2.4. Sắc kí
2.4.1. Định nghĩa
Sắc ký là q trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động đi xuyên qua pha tĩnh.
2.4.2. Phân loại
Theo trạng thái liên hợp của pha động và pha tĩnh Gồm sắc ký lỏng và sắc ký khí.
Theo cơ chế của q trình tách
Gồm sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký trao đổi ion và sắc ký rây phân tử.
Theo cách hình thành sắc đồ.
Gồm phương pháp tiền lưu, phương pháp đẩy, phương pháp rửa giải.
Phân loại theo thiết bị hình thành sắc đồ. Gồm sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng.
2.4.3. Sắc kí cột
Sắc ký cột là một dạng của sắc ký bản mỏng [1]. Trong sắc ký cột, chất hấp phụ pha tĩnh được nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà có thể triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh. Giống như sắc ký lớp mỏng, phương pháp này cũng dựa vào độ phân cực của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi cột chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong quá trình sắc ký. Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc phân bố tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột.
Kỹ thuật sắc ký cột:
Chuẩn bị chất hấp phụ và cột: Silicagel phải được hoạt hóa ở 120°C trong 4
giờ trước khi đưa lên cột. Cột sắc ký phải là một khối đồng nhất, phải thật khô và lắp thẳng đứng trên một giá cố định vững chắc [1].
Nhồi cột: Chất hấp phụ phải được phân tán đồng đều trong cột. Có 2 cách
cột, rót dung mơi vào cột và để chạy liên tục một thời gian để ổn định cột và không được để khô dung môi trong cột [1].
Đưa chất cần phân tách lên cột: Phải đưa chất lên cột sao cho chất phân tán
thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có nhiều cách đưa chất lên cột: phương pháp dùng đĩa giấy, cho thẳng dung dịch chất cần phân tách lên cột, trộn chất cần phân tách với một lượng chất hấp phụ [1].
Rửa cột: Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà
áp dụng cách rửa cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén. Hứng dịch chảy ra ở đáy cột theo phân đoạn, theo thời gian hoặc bằng ống nghiệm cùng thể tích [1]. .
Hình 2.22: Các bước tiến hành sắc ký cột
2.4.4. Sắc ký bản mỏng
Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đã đặt sẵn hỗn hợp chất cần phân tích. Pha tĩnh là chất hấp phụ được lựa chọn tùy theo yêu cầu phân tích, được trải mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định tùy theo mục đích cụ thể. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau [1]. Kết quả, thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng
dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung mơi. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến giá trị Rf.
Hình 2.23: Cách chuẩn bị một bản mỏng trong TLC
Các bước trong kỹ thuật sắc ký lớp mỏng:
Chuẩn bị bản mỏng: Bản mỏng trước khi dùng phải hoạt hóa trong tủ sấy và
sấy ở 105-110°C trong một giờ. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm. Dùng bút chì mềm kẻ bản mỏng. Vạch đường chấm chất phân tích, đường giới hạn di chuyển của dung mơi và đánh dấu vị trí chấm chất (các vết chấm cách nhau 0,5 cm và cách hai bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm).
Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Dùng ống mao quản hoặc micropipet
chấm chất lên các vị trí đã đánh dấu. Các vết chấm phải nhỏ, lượng chất phải đồng đều, không quá lớn dễ kéo vết hoặc chồng vết, cũng khơng q nhỏ khó hiện vết bằng thuốc thử.
Triển khai sắc ký: Bình triển khai thường là bình thủy tinh, có nắp đậy kín
và đáy phải bằng. Lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình. Pha hệ dung mơi với tỷ lệ thích hợp và vừa đủ, rót vào bình triển khai. Lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Đặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung mơi triển khai. Đậy kín bình và để n ở nhiệt độ khơng đổi. Khi dung môi chạy đến đường giới hạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình và sấy khơ bản mỏng rồi hiện vết.
Hiện vết trên bản mỏng: Có thể hiện vết bằng cách soi UV (bước sóng 254
Hình 2.24: Các bước tiến hành sắc ký lớp mỏng
2.5. Phương pháp vật lý hiện đại xác định cấu trúc phân tử
Quá trình xác định cấu trúc của một chất là một q trình tập hợp và phân tích các dữ liệu từ nhiều phương pháp khác nhau, mỗi cách cung cấp một số thông tin về cấu trúc của chất. Hiện nay, các phương pháp phân tích cấu trúc hiện đại đã được sử dụng để xác định cấu trúc gồm có: các phương pháp phổ hấp thụ như phổ tử ngoại (UV)/khả kiến (Vis) và phổ hồng ngoại (IR), các phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng (MS).
Các phương pháp phổ biến nhất là các phương pháp đo phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều (1H-NMR,
13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC…).
2.5.1. Phân tích cấu trúc hợp bằng phở cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân viết tắt là NMR (Nuclear Magnetic Resonance), là một phương pháp phân tích cấu trúc các hợp chất hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của các hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ carbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học. Trong phổ NMR có hai thơng số có đặc trưng liên quan đến cấu trúc hóa học của 1 phân tử là độ dịch chuyển hóa học (δ) và hằng số tương tác spin–spin (J).
2.5.2. Phổ proton 1H-NMR
Trong phổ 1H-NMR độ chuyển dịch hoá học (δ) của các proton được xác định trong thang TMS từ 0 ppm đến 14 ppm tuỳ thuộc vào mức độ lai hóa của các
hóa học khác nhau. Dựa vào độ chuyển dịch hố học, diện tích pic cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau mà người ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất. Dựa vào những đặc trưng của δ và tuơng tác J để có thể cung cấp các thông tin giúp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất.
2.5.3. Phở 13C-NMR
Phổ này cho tín hiệu vạch carbon. Mỗi nguyên tử carbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm nhưng với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 ppm đến 240 ppm). Ngồi ra phổ 13C cịn được ghi theo phương pháp DEPT
(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer). Phổ DEPT: Phổ này cho các tín hiệu phân loại các bậc carbon khác nhau.
Phổ DEPT 135 khơng cho tín hiệu của carbon bậc 4, tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía, cịn tín hiệu của CH2 nằm về phía đối diện. Trên phổ DEPT 90 chỉ có duy nhất tín hiệu phổ của CH. Kết hợp phổ 13C-NMR và phổ DEPT sẽ cho ta biết chính xác số carbon bậc 1, 2, 3, 4 [4].
2.5.4. Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)
Phổ HSQC cho biết sự liên quan giữa các tín hiệu của 1H và 13C. Phổ HSQC cho biết thông tin về liên kết trực tiếp giữa proton và carbon.
2.5.5. Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)
Đây là phổ thể hiện tương tác xa (2 liên kết và 3 liên kết) giữa carbon và proton trong phân tử và nhờ đó mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định. Phổ này đặc biệt thích hợp trong trường hợp phân tử chứa carbon bậc bốn vì nó thể hiện mối liên quan của tín hiệu proton 1H ở một nguyên tử 13C với tín hiệu của 13C khác ở cách xa nó 2-3 liên kết thậm chí trong một số trường hợp là bốn liên kết.
2.5.6. Phổ COSY (Correlation spectroscopy)
Phổ COSY biểu diễn các tương tác giữa proton – proton. Các proton tương tác với nhau trong phổ COSY là các proton liên kết với cùng một carbon hoặc với carbon liền kề. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được xác định.
2.5.7. Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy)
Phổ NOESY biểu diễn các tương tác không gian của các proton không kể đến độ dài các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách khơng gian của chúng được phân bố trong phân tử (khoảng 4A0). Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc khơng gian của phân tử.
2.6. Điều kiện thực nghiệm
Các dung mơi được sử dụng đều được mua bên ngồi thị trường, làm khan và chưng cất lại để loại bỏ tạp chất.
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản silica gel tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254, dày 0,2 mm (Merck), soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm.
Sắc ký cột (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung mơi dưới áp suất khí quyển. Chất hấp phụ cho sắc ký cột là silicagel.
1H-NMR được ghi trên máy Brucker Avance 500. 13C-NMR (với chương trình DEPT) được ghi trên máy Brucker Advance 500.
2.6.1. Tổng hợp β-amino alcohol Phương pháp tổng hợp chung:
Cho vào bình cầu 2 cổ (có dung tích 500mL) 2.4 đương lượng NaBH4 khuấy đều trong 200mL THF khan, đun hồi lưu trong mơi trường khí trơ N2. Sau đó thêm từ từ 1 đương lượng của (1a-d) vào hỗn hợp trên, sau đó làm lạnh về 00C bằng cách ngâm đá. Cho từ từ hỗn hợp chứa 1 đương lượng I2/THF (50mL) khan, khuấy đều trong vòng 40 phút. Sau khi q trình giải phóng khí kết thúc thì hỗn hợp được đun hồi lưu trong vịng 18h. Sau đó đưa hỗn hợp lên nhiệt độ phịng, thêm từ từ
methanol vào hỗn hợp sau phản ứng cho đến khi trở nên trong suốt. Tiếp tục khuấy trong vịng 30 phút và tiến hành đuổi dung mơi cho đến khi thu được chất rắn màu trắng. Hòa tan chất rắn này vào dung dịch KOH (20%, 150mL) khuấy trong vịng 4h, sau đó được chiết 3 lần với DCM (150mL), phần hữu cơ được làm khô với Na2SO4 khan và cô quay để thu được sản phẩm cuối cùng.
Acid carboxylic thường được khử về thành alcohol bậc I bằng tác nhân khử LiAlH4. Trong khi đó tác nhân khử NaBH4 yếu hơn LiAlH4 nên không thể khử acid