CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và mục đích nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Tổng hợp β-amino acid từ α-amino acid có sẵn trong tự nhiên.
Tổng hợp các mảnh peptide từ các β-amino acid bằng phản ứng coupling. 2.1.2. Mục đích nghiên cứu
Dựa trên các hoạt tính sinh học hữu ích của peptide, chúng tơi tiến hành tổng hợp các hợp chất peptidomimetic từ β-amino acid được điều chế từ các α-amino acid tương ứng nhằm tạo ra các hợp chất mới có khả năng đóng vai trị như một peptide nhằm tạo tiền đề cho các nghiên cứu về hoạt tính sinh học và ứng dụng của chúng trong lĩnh vực tìm kiếm thuốc mới.
2.2. Dụng cụ và hóa chất
2.2.1. Dụng cụ
Bếp điện, máy khuấy từ, cân phân tích.
Bình cầu hai cổ (500mL), bình cầu ba cổ (500mL), phễu nhỏ giọt (100mL), ống sinh hàn, cốc thủy tinh (100mL), cốc thủy tinh (250mL), đũa thủy tinh, phễu thủy tinh, phễu chiết.
Cột sắc kí, silicagel, TLC.
Máy lọc hút chân khơng, tủ hút, tủ sấy, máy cơ quay. 2.2.2. Hóa chất
Dung môi: methanol, dichlomethan, ethyl acetate, hexan, THF, DMSO, DMF.
L-Phenylalanine, L-Leucine, L-isoLeucine, L-Proline, L-Valine.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Khử carboxyl thành alcohol
Hình 2.18: Sơ đồ chung để khử nhóm carboxyl thành nhóm OH (Alcohol)
Acid carboxylic bị khử thành alcohol bậc I bằng cách sử dụng LiAlH4 [3, 7]. Sản phẩm trung gian của phản ứng này là aldehyde, nhưng khơng thể phân lập được vì chúng hoạt động hơn acid carboxylic ban đầu nên dễ dàng bị khử về thành alcohol.
2.3.2. Chuyển hóa nhóm amino thành carbamate (urethane)
Carbamate là các nhóm bảo vệ thường được sử dụng trong tổng hợp hữu cơ do các tác nhân bảo vệ dễ dàng tham gia phản ứng với nhóm amino và bảo vệ nhóm amino khỏi các tác nhân electrophile [3, 5, 7]. Độ bền của những nhóm này có thể được điều chỉnh bằng các nhóm O-alkyl. Với nhóm benzyloxycarbonyl (Cbz), nhóm phenyl khơng đủ làm cho nhóm này bị phân cắt trong dung dịch acid lỗng, trừ khi có mặt tác nhân nucleophile mạnh. Nhóm Cbz thường được phân cắt bằng các acid mạnh, như acid HBr, AcOH, acid TFA phân cắt nhóm này chậm hơn nhiều so với nhóm Boc. Tuy nhiên, nếu thay bằng nhóm p-metoxybenzyl (Moz) thì nhóm bảo vệ có thể được phân cắt bằng p-TsOH/acetone/CH3CN hoặc TFA/CH2Cl2. Thứ tự phân cắt tương đối các carbamate như sau: RNHMoz > RNHBoc > RNHCbz.
Tương tự nhóm OH (alcohol) nhóm amino cũng có thể được bảo vệ bằng nhóm t-BuCO. Tuy nhiên, phản ứng này cần thực hiện trong môi trường acid và trong điều kiện phản ứng, tính nucleophile của nhóm amine bị triệt tiêu hồn tồn do nó bị proton hóa rất dễ dàng. Vì vậy, người ta bảo vệ nhóm amino với nhóm tert- butyloxycarbonyl bằng phản ứng acyl hóa, t-butyl chloroformate (t-BuOCOCl) tương đối kém bền, do đó, dạng anhydride (t-BuOCO)2O (viết tắt: Boc2O) hoặc Boc-ON cùng một amine bậc ba thường được sử dụng nhiều hơn [3, 5, 7].
Nhóm Boc triệt tiêu đáng kể lực nucleophile của nguyên tử N trong nhóm amino, N-Boc tương đối bền với tác nhân hydro hóa, bền trong mơi trường base và
Bảng 2.1: Tác nhân và điều kiện phản ứng bảo vệ nhóm amino dưới dạng tert- butoxycarbamate
Tác nhân bảo vệ nhóm amino dạng Boc Điều kiện phản ứng bảo vệ
Boc2O, Et3N CH2Cl2, rt, 60 phút
Boc2O, NaHCO3 EtOAc, H2O, rt, 3h
Bảng 2.2: Tác nhân và điều kiện phản ứng phân cắt nhóm bảo vệ tert- butoxycarbamate của nhóm amino
Tác nhân phân cắt Điều kiện phản ứng phân cắt TFA CH2Cl2, 00C-rt, 20 phút – 6h TMSOTf, Et3N CH2Cl2, 00C-rt, 1h
AcCl EtOH, rt, 16h
Bảng 2.3: Tác nhân và điều kiện phản ứng bảo vệ nhóm amino dưới dạng benzyloxycarbamate
Tác nhân Điều kiện phản ứng bảo vệ
ClCO2Bn, Na2CO3 THF, rt, 24h
ClCO2Bn, K2CO3 MeCN, rt, 24h
Bảng 2.4: Tác nhân và điều kiện phản ứng phân cắt nhóm bảo vệ Cbz
Tác nhân Điều kiện phản ứng phân cắt
H2, Pd(OH)2 MeOH, rt, 3h
Pd, HCO2NH4 MeOH, rt, 14h
H2, Pd/C MeOH, rt, 4h
Cơ chế phản ứng gắn nhóm bảo vệ CbzCl:
Ví dụ:
Bảo vệ nhóm amino bằng Cbz [5]
2.3.3. Chuyển hóa nhóm OH thành dẫn xuất iodua bằng phản
ứng Appel
Sơ đồ chung của phản ứng:
Phản ứng chuyển hóa alcohol no thành dẫn xuất iodua khi cho tác dụng với I2 trong sự có mặt của PPh3 và imidazole.
Phản ứng Appel nhằm chuyển hóa alcohol thành dẫn xuất halogenua [35-38]. Cơ chế phản ứng đi qua các bước: sự halogen hóa triphenyl phosphine sau đó tạo alkoxide với alcohol. Phản ứng thế nucleophile đi theo cơ chế SN2 với sự tấn công của I- vào alkoxide tạo thành dẫn xuất halogenua, với sản phẩm phụ là triphenyl phosphine oxide PPh3=O.
2.3.4. Thế dẫn xuất halogenua bằng xianua Sơ đồ chung của phản ứng: Sơ đồ chung của phản ứng:
Phản ứng thế theo cơ chế SN2. Phản ứng này nhằm mục đích làm tăng 1C so với chất ban đầu. Từ dẫn xuất nitrile này ta có thể tiến hành nhiều phản ứng thứ cấp khác như thủy phân để thành acid carboxylic hoặc ester có nhiều hơn ít nhất 1C so với dẫn xuất iodua ban đầu [39].
Chuyển hóa nitrile thành acid carboxylic [39-41] Sơ đồ phản ứng chung:
Tùy thuộc vào điều kiện phản ứng (mơi trường acid/base) mà ta có các cơ chế phản ứng khác nhau.
Môi trường base:
Thủy phân nitrile trong môi trường kiềm (NaOH hoặc KOH) được tiến hành trong dung môi EtOH, đun hồi lưu. Cơ chế phản ứng như sau:
Môi trường acid:
Thủy phân trong môi trường acid thường được thực hiện trong môi trường acid mạnh và đun hồi lưu.
Chuyển hóa nitrile thành ester
Phản ứng cịn có tên gọi phản ứng Pinner, chuyển nitrile thành ester. Acol hay sử dụng cho phản ứng này là MeOH hoặc EtOH. Sơ đồ chung của phản ứng như sau:
2.3.5. Tổng hợp β-amino acid từ α-amino acid
Dựa vào các lí thuyết đã tóm tắt ở các mục trên chúng tơi đề xuất sơ đồ tổng hợp β-amino acid từ α-amino acid.
Hình 2.19: Sơ đồ tổng hợp β-amino acid từ α-amino acid.
2.3.6. Tổng hợp các mảnh peptide
Sau khi tổng hợp được các β-amino acid, tiến hành tổng hợp các mảnh peptide theo như mong muốn. Để tạo thành liên kết –CO-NH- giữa hai gốc β-amino acid thì cách thơng dụng nhất là thực hiện một chuỗi tổng hợp như sau:
Khóa nhóm amino bằng các nhóm bảo vệ.
Hoạt hóa nhóm carboxyl.
Ghép sản phẩm được hoạt hóa thu được với một amino acid khác.
Gỡ các nhóm bảo vệ.
Do đó, việc lựa chọn β-amino acid làm “đầu N” hay “đầu C” thì sẽ quyết định thời điểm gỡ các nhóm bảo vệ tương ứng.
Tác nhân DCC (Dicyclohexyl carbonidiimide)
DCC là một trong những tác nhân phổ biến trong tổng hợp hữu cơ [42], đặc biệt là sử dụng trong việc tổng hợp peptide từ 1955 trong các nghiên cứu của Sheehan và Hess, tiếp tục được dùng rộng rãi trong các nghiên cứu của Barany và
Cấu trúc của DCC: Tính chất vật lý:
Khơng tan trong nước nhưng tan trong dung môi DMF, DCM, THF, CH3CN.
Chất rắn dạng sáp, thường khó lấy ra khỏi lọ bảo quản.
Hơi độc. Nên khi làm việc với DCC cần được tiến hành trong tủ hút.
Dưới đây là sơ đồ tổng hợp liên kết peptide với tác nhân DCC, qua sơ đồ này có thể thấy ngồi vai trị là chất tạo liên kết peptide thì DCC có thêm vai trị hoạt hóa nhóm carboxyl của acid [42]. Sản phẩm phụ của q trình là dicyclohexyl urea (DCU) khơng tan trong nước và rất khó bị loại bỏ bằng sắc ký cột.
Hình 2.20: Sơ đồ hình thành liên kết peptide khi sử dụng tác nhân DCC
Tác nhân carbodiimide cải tiến EDCI.HCl hay EDC
Một dẫn xuất carbodiimide được cải tiến là N-(3-dimethylaminopropyl)-N’- ethylcarbodiimide [43], được dùng dưới dạng muối hydrochloride nên thường được viết tắt là EDCI.HCl hoặc EDC. Đây cũng là một tác nhân hoạt hóa nhóm carboxyl để ghép với các nhóm amine để tạo ra liên kết peptide.
Cấu trúc của EDC:
Chất trung gian O-Acylisourea
Liên kết amide amin
Với EDC thì hệ sau phản ứng tác dụng với dung dịch HCl sẽ chuyển thành muối ammonium dễ tan. Bản thân nhóm EDC với nhóm amine cũng phân cực hơn DCU nên được giữ lại trên silicagel tốt hơn, nên việc tinh chế sản phẩm khi sử dụng EDC sẽ dễ hơn khi sử dụng DCC [43].
Chất bổ trợ HOBt
Chất bổ trợ HOBt đều được sử dụng cùng với các tác nhân DCC hoặc EDC nhằm thúc đẩy khả năng hoạt động của các tác nhân và làm giảm khả năng hình thành các epimer cũng như N-acylurea là các sản phẩm phụ không mong muốn [44].
HOBt là tên viết tắt của 1-Hydroxybenzotriazole, có cơng thức cấu tạo như
sau:
HOBt được phát triển bởi W.Konig và R.Geiger vào năm 1970, đây là chất bổ trợ được sử dụng cho đến ngày nay. Đồng thời HOBt cịn có hạn chế khả năng raxemic hóa sản phẩm thu được khi sử dụng các tác nhân carbodiimide.
Hình 2.21: Cơ chế phản ứng giữa HOBt và sản phẩm trung gian khi sử dụng DCC
2.4. Sắc kí
2.4.1. Định nghĩa
Sắc ký là q trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động đi xuyên qua pha tĩnh.
2.4.2. Phân loại
Theo trạng thái liên hợp của pha động và pha tĩnh Gồm sắc ký lỏng và sắc ký khí.
Theo cơ chế của q trình tách
Gồm sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký trao đổi ion và sắc ký rây phân tử.
Theo cách hình thành sắc đồ.
Gồm phương pháp tiền lưu, phương pháp đẩy, phương pháp rửa giải.
Phân loại theo thiết bị hình thành sắc đồ. Gồm sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng.
2.4.3. Sắc kí cột
Sắc ký cột là một dạng của sắc ký bản mỏng [1]. Trong sắc ký cột, chất hấp phụ pha tĩnh được nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà có thể triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh. Giống như sắc ký lớp mỏng, phương pháp này cũng dựa vào độ phân cực của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi cột chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong quá trình sắc ký. Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc phân bố tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột.
Kỹ thuật sắc ký cột:
Chuẩn bị chất hấp phụ và cột: Silicagel phải được hoạt hóa ở 120°C trong 4
giờ trước khi đưa lên cột. Cột sắc ký phải là một khối đồng nhất, phải thật khô và lắp thẳng đứng trên một giá cố định vững chắc [1].
Nhồi cột: Chất hấp phụ phải được phân tán đồng đều trong cột. Có 2 cách
cột, rót dung mơi vào cột và để chạy liên tục một thời gian để ổn định cột và không được để khô dung môi trong cột [1].
Đưa chất cần phân tách lên cột: Phải đưa chất lên cột sao cho chất phân tán
thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có nhiều cách đưa chất lên cột: phương pháp dùng đĩa giấy, cho thẳng dung dịch chất cần phân tách lên cột, trộn chất cần phân tách với một lượng chất hấp phụ [1].
Rửa cột: Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà
áp dụng cách rửa cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén. Hứng dịch chảy ra ở đáy cột theo phân đoạn, theo thời gian hoặc bằng ống nghiệm cùng thể tích [1]. .
Hình 2.22: Các bước tiến hành sắc ký cột
2.4.4. Sắc ký bản mỏng
Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đã đặt sẵn hỗn hợp chất cần phân tích. Pha tĩnh là chất hấp phụ được lựa chọn tùy theo yêu cầu phân tích, được trải mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định tùy theo mục đích cụ thể. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau [1]. Kết quả, thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng
dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung mơi. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến giá trị Rf.
Hình 2.23: Cách chuẩn bị một bản mỏng trong TLC
Các bước trong kỹ thuật sắc ký lớp mỏng:
Chuẩn bị bản mỏng: Bản mỏng trước khi dùng phải hoạt hóa trong tủ sấy và
sấy ở 105-110°C trong một giờ. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm. Dùng bút chì mềm kẻ bản mỏng. Vạch đường chấm chất phân tích, đường giới hạn di chuyển của dung mơi và đánh dấu vị trí chấm chất (các vết chấm cách nhau 0,5 cm và cách hai bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm).
Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Dùng ống mao quản hoặc micropipet
chấm chất lên các vị trí đã đánh dấu. Các vết chấm phải nhỏ, lượng chất phải đồng đều, không quá lớn dễ kéo vết hoặc chồng vết, cũng khơng q nhỏ khó hiện vết bằng thuốc thử.
Triển khai sắc ký: Bình triển khai thường là bình thủy tinh, có nắp đậy kín
và đáy phải bằng. Lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình. Pha hệ dung mơi với tỷ lệ thích hợp và vừa đủ, rót vào bình triển khai. Lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Đặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung mơi triển khai. Đậy kín bình và để n ở nhiệt độ khơng đổi. Khi dung môi chạy đến đường giới hạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình và sấy khơ bản mỏng rồi hiện vết.
Hiện vết trên bản mỏng: Có thể hiện vết bằng cách soi UV (bước sóng 254
Hình 2.24: Các bước tiến hành sắc ký lớp mỏng
2.5. Phương pháp vật lý hiện đại xác định cấu trúc phân tử
Quá trình xác định cấu trúc của một chất là một q trình tập hợp và phân tích các dữ liệu từ nhiều phương pháp khác nhau, mỗi cách cung cấp một số thông tin về cấu trúc của chất. Hiện nay, các phương pháp phân tích cấu trúc hiện đại đã được sử dụng để xác định cấu trúc gồm có: các phương pháp phổ hấp thụ như phổ tử ngoại (UV)/khả kiến (Vis) và phổ hồng ngoại (IR), các phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng (MS).
Các phương pháp phổ biến nhất là các phương pháp đo phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều (1H-NMR,
13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC…).
2.5.1. Phân tích cấu trúc hợp bằng phở cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân viết tắt là NMR (Nuclear Magnetic Resonance), là một phương pháp phân tích cấu trúc các hợp chất hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của các hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ carbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học. Trong phổ NMR có hai thơng số có đặc trưng liên quan đến cấu trúc hóa học của 1 phân tử là độ dịch chuyển hóa học (δ) và hằng số tương tác spin–spin (J).
2.5.2. Phổ proton 1H-NMR
Trong phổ 1H-NMR độ chuyển dịch hoá học (δ) của các proton được xác định trong thang TMS từ 0 ppm đến 14 ppm tuỳ thuộc vào mức độ lai hóa của các