CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.4. Các phương pháp hóa sinh
Phƣơng pháp kiểm tra hoạt tính amylase
Do trao đổi chéo kép, gen amyE bị mất tính nguyên vẹn dẫn đến mất hoạt
tính amylase. Do đó, thể tái tổ hợp khơng có khả năng phân giải tinh bột. Dịch ni cấy của các thể biến nạp đƣợc thu sau các thời điểm thích hợp, ly tâm thu dịch và nhỏ trên đĩa thạch đục lỗ có bổ sung tinh bột (0,1%), ủ 37oC trong 8 giờ, nhuộm đĩa bằng dung dịch lugol. Các thể biến nạp khơng có khả năng phân giải tinh bột (khơng có vịng sáng trên đĩa) đƣợc lựa chọn.
Phƣơng pháp định tính bằng phản ứng enzyme β-galactosidase với X-gal
Nguyên lý: Hoạt tính enzyme β-galactosidase đƣợc định tính dựa vào khả
năng β-galactosidase thuỷ phân X-gal. Nếu vi khuẩn mang gen lacZ, enzyme β-
thành khuẩn lạc màu xanh. X-gal đƣợc hoà tan trong dimethylformamide ở nồng độ 40 g/ml. Dung dịch gốc này đƣợc bảo quản trong tối ở nhiệt độ 40C.
Môi trƣờng thạch dùng để cấy hoặc phân lập bình thƣờng đƣợc khử trùng và làm nguội đến nhiệt độ khoảng 550C, sau đó thêm X-gal đến nồng độ cuối là 8
g/ml. Không thêm X-gal vào khi nhiệt độ môi trƣờng lớn hơn 550C do tại nhiệt độ lớn hơn 550C X-gal không bền và sẽ bị phân huỷ. Cấy vi khuẩn lên trên đĩa này. Sau thời gian nuôi cấy (tùy thuộc vào đặc tính của mỗi chủng riêng biệt), các chủng vi khuẩn tạo khuẩn lạc màu xanh trên đĩa biểu thị là chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme -galactosidase, cịn các chủng khơng có khả năng sinh
enzyme -galactosidase sẽ tạo khuẩn lạc màu trắng [71].
Phƣơng pháp định lƣợng bằng phản ứng enzyme β-galactosidase với cơ chất ONPG
Nguyên lý: Hợp chất ONPG là hợp chất không màu. -galactosidase sẽ thủy
phân ONPG thành galactose và ortho-nitrophenol (oNP) (màu vàng). Ortho- nitrophenol hấp thụ ở bƣớc sóng 420 nm. Hoạt độ -galactosidase đƣợc xác định là lƣợng enzyme giải phóng 1 µmol oNP trong 1 phút ở 370C trong 1 đơn vị thể tích [32].
Tiến hành: Nuôi khuẩn lạc tái tổ hợp trên mơi trƣờng DSM bổ sung kháng sinh chloramphenicol (50 µg/ml)và thu 1 ml dịch tại các thời điểm thích hợp để đo, rồi ly tâm thu cặn tế bào. Rửa cặn bằng 500 µl dung dịch đệm Tris-HCl pH 8. Bổ sung 500 µl dung dịch đệm Z và 20 µl toluen, vortex 30 giây, ủ đá 20 phút. Bổ sung 200 µl ONPG, ủ nhiệt độ 30oC trong 1 giờ. Ngừng phản ứng bằng 250 µl Na2CO3 1 M. Ly tâm mẫu, đo OD420nm và tính hoạt tính của enzyme theo cơng thức:
Time: thời gian phản ứng (phút) Vol: thể tích mẫu thu (ml)
OD420: Đo mẫu ở bước sóng 420 nm OD600: Đo mẫu ở bước sóng 600 nm
(Time) (Time) * (Vol) * (OD600)
OD420 * 1000