Các thiết bị thí nghiệm

Tên thiết bị Xuất xứ

Bể ổn nhiệt Eppendorf (Đức)

Box cấy vi sinh vật clean bench Nuaire (Mỹ)

Cân phân tích Sartorius (Thụy sỹ)

Máy đo pH Horiba (Mỹ)

Máy lắc ổn nhiệt N-biotek (Hàn Quốc)

Hệ thống chụp ảnh gel Doc Bio-rad (Mỹ)

Máy lắc rung Inka (Đức)

Máy li tâm lạnh nhỏ 5417R Eppendorf (Đức)

Máy li tâm lạnh lớn 5810R Eppendorf (Đức)

Máy PCR Eppendorf (Đức)

Máy đo OD Beckman coulter (Mỹ)

Tủ lạnh sâu -20C, -80C Sanyo, Toshiba (Nhật)

2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu

2.2.2. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật

Nuôi cấy E. coli: E. coli bảo quản ở -80C đƣợc cấy vạch lên đĩa thạch để

hoạt hóa, ủ ở 37°C qua đêm. Một khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa thạch đƣợc lấy và nuôi

Genome Bacillus subtilis PY79

PrrnO (xử lý với BglII và XbaI)

Cặp mồi đặc hiệu PrrnO F/R Tối ƣu hóa điều kiện phản ứng PCR

pUL1

RBS (spoVG) xử lý XbaI và NcoI

Tối ƣu hóa phản ứng cắt, nối pUL1 và lacZ

PCR lacZ từ khuôn pDG268

pUL1-lacZ

Cặp mồi đặc hiệu PrrnO F/lacZ R Tối ƣu hóa điều kiện phản ứng PCR pET28b xử lý với NcoI và BglII

PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ Tối ƣu hóa phản ứng cắt, nối pDG364

và PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ

Vector pDG364

pUL2

Tế bào khả biến B. subtilis PY79 Môi trƣờng chọn lọc

Biến nạp và kiểm tra sự cài nhập

Thử hoạt tính với cơ chất ONPG Đo hoạt độ với cơ chất ONPG

Biểu hiện và xác định hoạt độ β- galactosidase

trong 2 ml LB lỏng, lắc 150 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Các chủng tái tổ hợp đƣợc ni trong các mơi trƣờng có bổ sung chất kháng sinh thích hợp.

Ni cấy B. subtilis: Các chủng B. subtilis PY79 và B. subtilis tái tổ hợp

đƣợc nuôi cấy trên đĩa DSM và từng khuẩn lạc đơn đƣợc lấy và nuôi trong 3 ml DSM lỏng, lắc 150 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Các chủng tái tổ hợp đƣợc nuôi trong các mơi trƣờng bổ sung chất kháng sinh thích hợp.

2.2.3. Các phương pháp sinh học phân tử

Nhân bản gen (PCR)

Nguyên tắc: PCR là phƣơng pháp dùng enzyme khuếch đại chọn lọc một

đoạn DNA theo luật số mũ. Phản ứng nhân gen đƣợc thực hiện với DNA polymerase chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và bốn loại deoxyribonucleotide (dATP, dGTP, dCTP và dTTP).

Mỗi chu kỳ phản ứng nhân gen gồm 3 bƣớc: bƣớc 1 là biến tính DNA bằng cách tăng nhiệt độ phản ứng lên 94°C-95°C (tách hai sợi đơn từ sợi khuônxoắn kép), bƣớc 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn, bƣớc 3 là kéo dài chuỗi theo mồi, chiều 5′-3′ với quá trình kéo dài gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung.

Tính đặc hiệu của phản ứng đƣợc quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khn giữa hai mồi. Nhƣ vậy, kết quả của phản ứng PCR là tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ.

Tiến hành: PrrnO, gen lacZ, đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ đƣợc nhân bản

bằng các cặp mồi với trình tự enzyme giới hạn đƣợc gạch chân (bảng 2.2) trong phản ứng PCR có thành phần nhƣ bảng 2.5.