Giếng số 1: đối chứng âm (khơng có khn); giếng số 2, 3: lacZ đƣợc khuếch đại từ pDG268 với nồng độ pha loãng khác nhau; giếng M: DNA marker (Express DNA Ladder)
Dựa vào kết quả điện di trên gel agarose 1% chúng tôi nhận thấy rằng băng
lacZ (khoảng 3 kb) xuất hiện đậm và rõ. Điều này chứng tỏ lacZ đã đƣợc khuếch
đại thành công với số lƣợng lớn.
3.2.2. Nhân dòng gen lacZ trong vector pUL1
Sản phẩm PCR khuếch đại gen lacZ cùng với vector pUL1 đƣợc cắt bằng các enzyme giới hạn BamHI và HindIII. Thành phần phản ứng cắt đƣợc trình bày
trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt lacZ và pUL1
Thành phần phản ứng Thể tích (μl) Nồng độ cuối cùng Điều kiện
Đệm Tango 10x 10 2x
Ủ 370C trong 3h.
BamHI 1 10 U/µl
HindIII 1 10 U/µl
DNA (sản phẩm PCR lacZ hoặc
vector plasmid pUL1) 17 50-100 ng/µl
H2O 21
Chúng tôi chạy điện di sản phẩm phản ứng cắt trong 50 phút và 95V. Sản phẩm điện di đƣợc tinh sạch bằng kit QIA quick gel extration. Tiếp đó, chúng tơi
tiến hành phản ứng nối lacZ vào pUL1 với tỉ lệ thích hợp sao cho tổng thể tích là 12 µl. Phản ứng nối đƣợc ủ qua đêm ở 160C với các thành phần đƣợc tối ƣu hóa nhƣ sau:
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng nối lacZ vào pUL1
Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ cuối cùng
H2O 5
Đệm 10x 2 1x
Enzyme T4 ligase 1 5 U/µl
(pUL1 + sản phẩm khuếch đại lacZ) đã cắt 12 50-100 ng/µl
Tổng thể tích 20
Sản phẩm ghép nối trên đƣợc biến nạp vào E. coli DH5α theo phƣơng pháp
sốc nhiệt và các thể biến nạp trải trên đĩa LB agar bổ sung kháng sinh kanamycin (30 µg/ml). Để kiểm tra các khuẩn lạc có plasmid pUL1 mang đoạn chèn lacZ hay không chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng phản ứng PCR colony. Sản phẩm PCR colony đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR colony kiểm tra đoạn lacZ chèn trong plasmid pUL1 của 5 khuẩn lạc
Giếng 1-5 sản phẩm PCR colony của 5 khuẩn lạc, giếng (-): đối chứng âm, giếng M: sản phẩm PCR của lacZ đƣợc khuếch đại từ khuôn pDG268
Trong 5 khuẩn lạc đƣợc kiểm tra, có 2 khuẩn lạc (số 1 và 2) chứa vector pUL1 mang đoạn chèn lacZ. Khuẩn lạc cho kết quả dƣơng tính (khuẩn lạc số 1) sẽ
đƣợc ni trong mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung kanamycin (30 µg/ml) để tách chiết plasmid. Plasmid này sau đó đƣợc cắt bằng hai enzyme cắt giới hạn BamHI và HindIII, đệm Tango 2x và đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả
thu đƣợc nhƣ sau:
Hình 3.6. Kết quả điện di trên gel agarose 1% kiểm tra sản phẩm chèn lacZ vào pUL1
Giếng M: DNA marker (Express DNA Ladder); giếng 1: sản phẩm PCR gen lacZ; giếng 2: sản phẩm cắt pUL1-lacZ
Kết quả điện di trên cho thấy trên giếng số 2 xuất hiện băng có kích thƣớc nhƣ sản phẩm PCR của lacZ (khoảng 3kb) và điều này chứng tỏ chúng tôi đã nhân dịng thành cơng đoạn lacZ trong vector pUL1.
3.3 Nhân dòng đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong vector pDG364 tạo pUL2
3.3.1. Khuếch đại đoạn DNA gồm promoter PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong pUL1 trong pUL1
Đoạn DNA bao gồm promoter PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ đƣợc khuếch đại từ vector tái tổ hợp pUL1-lacZ bằng cặp mồi đặc hiệu nhƣ đƣợc trình bày trong phần nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu. Phản ứng PCR với Taq DNA
polymerase có hoạt tính đọc sửa đƣợc thực hiện ở nhiều nhiệt độ gắn mồi khác nhau. Qua đó, thành phần và điều kiện phản ứng đƣợc tối ƣu hóa nhƣ bảng 3.5.
1 2 M
3 kb
5kb
Bảng 3.5. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ
Thành phần Thể tích (μl) Nồng độ cuối cùng
H2O 13,8
dNTPs + Đệm 10x 2,0 2 mM
Mồi xuôi PrrnO-F 0,4 0,25 mM
Mồi ngƣợc lacZ-R 0,4 0,25 mM
Taq DNA polymerase có hoạt
tính đọc sửa 0,4 1 U/µl
Plasmid khn 3,0 50-100ng/µl
Tổng thể tích 20
Chu trình nhiệt:
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên agarose 1%: