CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.2. Tách chiết DNA từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thƣ bằng hạt nano
từ bọc silica và bộ đệm pha chế
Chia mẫu: Mẫu mô vùi parafin đƣợc cắt thành từng lát mỏng có độ dày khoảng
1mm, dài khoảng 20-50 mm. Dùng cân tiểu ly cân các lát mô đƣợc cắt sao cho khối lƣợng mô khoảng 10 mg/phản ứng.
Xử lý parafin: mẫu đƣợc xử lý với dung dịch dầu khoáng để loại bỏ lớp parafin. Sau
đó, sử dụng cồn và nƣớc để rửa sạch lƣợng dầu khống cịn sót lại, chỉ giữ lại mơ.
Quy trình tách DNA từ mẫu mơ FFPE:
Đầu tiên, 20 µl proteinase K và 200 µl LB (LB1, LB2, LB3) đƣợc bổ sung vào 10 mg mẫu mô ung thƣ đã đƣợc loại bỏ parafin bằng dầu khoáng. Mẫu đƣợc ủ ở 60oC trong 1 giờ để ly giải mơ giải phóng DNA, và tiếp tục ủ ở 90oC trong 1 giờ để loại bỏ liên kết chéo. 400 µl BB (BB1, BB2, BB3), 200 µl isopropanol và 50 µl hạt nano từ bọc silica (M1, M2, M3) đƣợc bổ sung vào mẫu để DNA đƣợc gắn lên hạt MagSi nano. Mẫu đƣợc đặt lên giá nam châm để tập trung phức hệ hạt gắn DNA và loại bỏ các tạp chất. 500 µl WB1 và 500 µl WB2 lần lƣợt đƣợc bổ sung vào hạt để rửa bỏ các tạp chất cịn sót lại trƣớc khi chiết đẩy DNA ra khỏi hạt bằng 50 µl EB. DNA đƣợc bảo quản ở -20oC hoặc sử dụng ngay cho phản ứng PCR tiếp theo.
2.2.3. Tách chiết DNA từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thƣ bằng hạt nano từ bọc silica bằng bộ kit thƣơng mại MagMAX FFPE DNA Isolation kit từ bọc silica bằng bộ kit thƣơng mại MagMAX FFPE DNA Isolation kit (Thermo Scientific)
Chuẩn bị RNase Solution: trƣớc tiên, chuẩn bị RNase Solution, bảo quản trên đá cho đến khi sử dụng: với tỷ lệ RNase A: Nuclease-Free Water là 1: 99 (thể tích RNase Solution cần dùng cho 1 phản ứng là 100 µl)
Chuẩn bị mẫu
Bƣớc 1: Cắt 1 hoặc 2 miếng mẫu kích thƣớc khoảng 10 μm, chuyển sang các giếng thí nghiệm
Bƣớc 2: Thêm 150 μl Digestion Buffer vào mỗi giếng mẫu và ngâm các mẫu ở trong đệm
Bƣớc 3: Thêm 4 μl Proteinase K và 30 μl DNA Digestion Additive vào mỗi giếng mẫu
Bƣớc 4: Che đĩa và ủ mẫu 60oC trong 60 phút, sau đó lên 80oC trong 30 phút Bƣớc 5: Trong thời gian ủ mẫu, chuẩn bị 620 µl Binding Solution cho mỗi phản ứng bao gồm 200 µl Binding Buffer và 420 µl isopropanol
Bƣớc 6: Sau khi ủ mẫu tại 80oC, thêm 620 μl Binding Solution vào mỗi giếng mẫu, spin đĩa mẫu trong 5 giây, ủ đĩa tại nhiệt độ phòng trong 5 phút
Gắn DNA với Ncleic Acid Binding Beads
Bƣớc 1: Thêm 20 μl Nucleic Acid Binding Beads vào mỗi giếng mẫu, sau đó lắc trong 3 phút với tốc độ 3-4, mix các giếng mẫu cẩn thận bằng pipet 10-12 lần
Bƣớc 2: Đặt đĩa mẫu lên đế từ 96 trong 3-5 phút hoặc cho đến khi dung dịch sạch
Bƣớc 3: Cẩn thận hút và bỏ phần dịch nổi
Rửa Nucleic Acid Binding Beads
Bƣớc 1: Nhấc đĩa mẫu ra khỏi đế từ 96 và thêm 150 μl Wash Solution 1 vào mỗi giếng mẫu
Bƣớc 3: Đặt đĩa mẫu lên đế từ 96 trong 1-2 phút hoặc đến khi dung dịch sạch Bƣớc 4: Cẩn thận hút và bỏ phần dịch nổi
Bƣớc 5: Nhấc đĩa mẫu ra khỏi đế từ 96 và thêm 150 μl Wash Solution 2 vào mỗi giếng mẫu
Lặp lại bƣớc 2, 3, 4
Bƣớc 6: Không che đĩa mẫu và lắc trong 2 phút tại tốc độ 9 để làm khô Nucleic Acid Binding Beads
Xử lý Rnase A
Bƣớc 1: Thêm 100 µl Rnase Solution vào mỗi giếng mẫu, sau đó lắc trong 2 phút với tốc độ 8
Bƣớc 2: Che đĩa mẫu và ủ tại nhiệt độ 37oC trong 20 phút Bƣớc 3: Lắc đĩa trong 5-10 phút với tốc độ 8
Bƣớc 4: Chuẩn bị Rebinding Solution bao gồm 100 µl Rebinding Buffer và 200 µl Isopropanol cho mỗi phản ứng
Bƣớc 5: Thêm 300 µL Rebinding Solution vào mỗi giếng mẫu sau đó lắc 3 phút. Bƣớc 6: Đặt đĩa mẫu lên đế từ 96 trong 3-4 phút hoặc để đến khi dung dịch sạch
Bƣớc 7: Hút và loại bỏ dịch nổi
Rửa và chiết đẩy mẫu
Bƣớc 1: Nhấc đĩa mẫu ra khỏi đế từ 96 và thêm 150 μl Wash Solution 2 vào mỗi giếng mẫu, che đĩa mẫu và lắc trong 1 phút
Bƣớc 2: Đặt đĩa mẫu lên đế từ 96 trong 1-2 phút hoặc đến khi dung dịch sạch Bƣớc 3: Cẩn thận hút và bỏ phần dịch nổi.
Bƣớc 4 : Không che đĩa mẫu và lắc đĩa để làm khô mẫu
Bƣớc 5: Thêm 70 μl Elution Buffer sau đó che và lắc đĩa trong 1 phút Bƣớc 6: Ủ và lắc đĩa mẫu trong 4 phút tại 80oC
Bƣớc 7: Đặt đĩa mẫu lên đế từ 96 trong 3-4 phút hoặc đến khi dung dịch sạch Bƣớc 8: Chuyển dịch nổi sang ống mới