CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.6. Real-time PCR phát hiện EBV
Phƣơng pháp phát hiện dựa trên nguyên lý Real time PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu EBV-74 của EBV, Probe dùng cho phản ứng Real time PCR đƣợc thiết kế theo cơng nghệ TaqMan probe. Khi có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, Taqman probes đặc hiệu với trình tự đích sẽ bắt cặp vào sản phẩm khuếch đại và sẽ bị phân giải bởi enzyme Taq polymerase (nhờ hoạt tính 5’-3’ exonuclease) khi tổng hợp sợi bổ sung ở giai đoạn kéo dài. Sự thủy phân Taqman probe sẽ làm tách rời chất phát huỳnh quang (fluorophore) FAM ở đầu 5’ khỏi chất hấp phụ huỳnh quang (Quencher) ở đầu 3’ của probes, nhờ vậy ống phản ứng sẽ phát huỳnh quang khi bị chiếu tia cực tím hay laser và sự phát huỳnh quang này sẽ đƣợc ghi nhận bởi đầu đọc Real-time của máy. Mẫu có chứa nhiều bản gen đích sẽ có chu kì ngƣỡng (Ct = chu kỳ mà đầu đọc Real time của máy bắt đầu ghi nhận đƣợc có tín hiệu huỳnh quang trong ống phản ứng) phát hiện sớm hơn mẫu có ít bản gen đích.
Để đánh giá quá trình tách cũng nhƣ phản ứng Real-time PCR, chúng tôi chạy song song với gen nội chuẩn là một gen của ngƣời mã hóa β- globulin có trực tiếp trong mẫu bệnh phẩm. DNA nội chuẩn sử dụng cặp mồi và probes đặc hiệu khuếch đại đoạn gen mã hóa β- globulin theo cùng nguyên lý TaqMan MGB, Probe đƣợc gắn chất huỳnh quang HEX đảm bảo phản ứng Real time PCR không bị ức chế bởi các tác nhân trong quá trình tách chiết từ mẫu bệnh phẩm. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm IQ5 Optical System (Bio - Rad). Hỗn hợp phản ứng đƣợc chạy trên máy Real-time PCR của Bio-Rad với chu trình nhệt sau:
Giai đoạn hoạt hóa enzyme 95oC 10 phút
45 chu kỳ
Giai đoạn biến tính 95oC 10 giây
Giai đoạn gắn mồi và kéo dài 60oC 1 phút
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng Real-time PCR phát hiện EBV Thành phần Thể tích Thành phần Thể tích Master mix 12,5 l EBV-Fw (10 pmol) 0,5 l EBV-Rv (10 pmol) 0,5 l P-EBV (10 pmol) 0,2 l Betaglobin-Fw (10 pmol) 0,5 l Betaglobin-Rv (10 pmol) 0,5 l Betaglobin-probe (10 pmol) 0,1 l H2O cất khử trùng, khử ion 5,2 l DNA khuôn 5 l