Thành phần Thể tích Master mix 12,5 l EBV-Fw (10 pmol) 0,5 l EBV-Rv (10 pmol) 0,5 l P-EBV (10 pmol) 0,2 l Betaglobin-Fw (10 pmol) 0,5 l Betaglobin-Rv (10 pmol) 0,5 l Betaglobin-probe (10 pmol) 0,1 l H2O cất khử trùng, khử ion 5,2 l DNA khuôn 5 l
2.2.7. Real-time nested PCR phát hiện HPV
Phƣơng pháp phát hiện HPV bằng kỹ thuật real-time PCR sẽ đƣợc cải tiến từ các phƣơng pháp công bố trƣớc đây phát hiện HPV trong các mẫu dịch quét âm đạo (Snider và cộng sự, 1990; Roda Husman và cộng sự, 1995; Jiang và cộng sự, 1997). Cụ thể, 5 l DNA tách chiết từ mô UTVMH FFPE đƣợc sử dụng làm khuôn cho
phản ứng nested real time PCR phát hiện trình tự đặc hiệu cho HPV nhƣ sau: Phản ứng PCR vòng 1 đƣợc thực hiện trong 35 chu kỳ với điều kiện 94°C 1 phút, 40°C 2 phút, và 72°C 1 phút sử dụng primer HPV-Fw1, HPV-Rv1 để nhân đoạn gen 270 bp. Sau đó vịng 2 real-time nested-PCR đƣợc thực hiện dƣới điều kiện nhiệt độ tƣơng tự nhƣng với cặp primer khác HPV-Fw2, HPV-Rv2 để nhân đoạn gen kích thƣớc 150 bp.
2.2.8. Giải trình tự gen
Sản phẩm PCR nhân đoạn gen đặc hiệu Braf đƣợc điện di trên gel agarose
1,5% để kiểm tra độ sáng và vị trí của băng sau đó đƣợc tinh sạch bởi ANAPURE PCR & Gel Purification kit (ANABIO), và gửi đi giải trình tự (IDT, Mỹ).
2.2.9. Phƣơng pháp phân tích gen
Trình tự DNA đƣợc phân tích bởi phần mềm ApE (Đại học Uta, Mỹ) kết hợp cơ sở dữ liệu tin sinh học NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Khoảng 20-30 nuceotide ở 2 đầu bị nhiễu do mồi đƣợc cắt bỏ. Trình tự cịn lại đƣợc BLAST và so sánh với trình tự với trình tự gen Braf có trên nhiễm sắc thể số 7 ở ngƣời (từ
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ
3.1. CHẾ TẠO BỘ KIT TÁCH DNA TỪ MÔ FFPE SỬ DỤNG HẠT TỪ BỌC SILICA SILICA
3.1.1. Đệm Lysis Buffer, Binding Buffer phù hợp với tách chiết DNA từ mơ FFPE FFPE
Trong q trình tối ƣu và so sánh kit, thay vì sử dụng ln tiêu bản mơ FFPE UTVMH với lƣợng mẫu hạn chế (chỉ đủ cho lặp lại 3-5 lần thí nghiệm), chúng tơi sử dụng các khối mô FFPE UTĐTT với lƣợng mẫu dồi dào hơn, đủ cho việc lặp lại thí nghiệm tối thiểu 9 lần (3 loại đệm x 3 lần lặp; 3 loại hạt x 3 lần lặp) trên mỗi mẫu nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trong tối ƣu bộ đệm LB và BB (hai loại đệm đóng vai trị quan trọng trong việc tách DNA từ mẫu mô FFPE) cho bộ kit tách DNA từ mô FFPE. Đệm LB gồm 3 công thức đệm đƣợc pha chế và mã hóa với tên LB1, LB2, và LB3. Các đệm LB đều chứa một số thành phần cơ bản nhƣ Tris-HCl, SDS, Trixton-X100 và khác nhau cơ bản ở pH, pH ở đệm LB1, LB2, LB3 lần lƣợt là 7; 8; 9. Đệm BB cũng gồm 3 công thức đệm đƣợc pha chế và mã hóa với tên BB1, BB2, và BB3. Các đệm BB chứa thành phần cơ bản là GuHCl, TrisHCl, các đệm BB khác nhau cơ bản ở nồng độ GuHCl, nồng độ GuHCl ở đệm BB1 là 2 M, BB2 là 3 M và BB3 là 4M. Các đệm Washing và Elution Buffer khơng đóng vai trị quan trọng và thừa hƣởng kết quả từ nghiên cứu trƣớc. Ba loại đệm LB và BB đƣợc pha chế, có thành phần cơ bản là đệm Tris, Guanidin, NaCl và đƣợc bổ sung thêm 1 số muối, chất diện hoạt có nồng độ khác nhau (xin phép không bộc lộ công thức chi tiết ở đây vì là kết quả liên quan tới đề tài) và đƣợc kí hiệu nhƣ Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kí hiệu và sự khác nhau cơ bản giữa các bộ đệm*
Tên bộ đệm Ký hiệu các đệm và sự khác biệt cơ bản
Bộ đệm 1 LB1 (pH 7) BB1 (nồng độ GuHCl 2 M)
Bộ đệm 2 LB2 (pH 8) BB2 (nồng độ GuHCl 3 M)
Sử dụng các đệm này phối hợp với hạt M1 (đƣợc lấy ngẫu nhiên trong ba loại hạt cung cấp bới Trung tâm Nano và năng lƣợng là M1, M2, M3) để tách chiết DNA từ mô ung thƣ đúc trong khối nến. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên mẫu mô của 5 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng (BN 1, BN 2, BN 3, BN 4, BN 5), sử dụng ba loại đệm khác nhau với cùng một loại hạt M1. Mỗi thí nghiệm đều sử dụng khối lƣợng mô FFPE bằng nhau là 10 mg, đồng thời mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần để tìm ra bộ đệm cho hiệu quả tách chiết cao nhất.
DNA của 5 bệnh nhân tách chiết bởi ba bộ đệm khác nhau đƣợc đem đi đo nồng độ và độ tinh sạch bằng phƣơng pháp quang phổ kế sử dụng máy Nano Drop ND-1000 (Thermo-Scientific, USA). Nồng độ DNA của 5 bệnh nhân khi tách chiết bởi ba bộ đệm đƣợc trình bày trên biểu đồ cột Hình 3.1. Vì mỗi thí nghiệm tách chiết đƣợc lặp lại 3 lần (n = 3) nên số liệu trên biểu đồ cột là giá trị trung bình của 3 lần tách chiết.
Hình 3.1: So sánh nồng độ DNA của 5 bệnh nhân khi tách chiết bởi 3 bộ đệm 1, 2, và 3 (n = 3)
Từ Hình 3.1 thấy đƣợc nồng độ DNA khi tách bởi bộ đệm 2 cho giá trị cao nhất ở cả 5 bệnh nhân (102,8 ± 6,94 ng/µl ở mẫu BN 1, 84,1 ± 4,99 ng/µl ở mẫu BN 2, 201,67 ± 15,09 ng/µl ở mẫu BN 3, 163,0 ± 11,7 ng/µl ở mẫu BN 4 và 107,33 ± 5,29 ng/µl ở mẫu BN 5), cao hơn khoảng 2 lần so với hai bộ đệm còn lại. DNA tách chiết bằng cả ba bộ đệm đều cho độ tinh sạch tốt với giá trị A260/A280 trong khoảng 1,9- 2,2 (Bảng 3.2). 0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 Bộ đệm 1 Bộ đệm 2 Bộ đệm 3 N ồn g đ ộ D N A (ng/ µl) BN 1 BN 2 BN 3 BN 4 BN 5
Bảng 3.2: Kết quả đo độ tinh sạch DNA của 5 bệnh nhân tách bởi 3 bộ đệm khác nhau (n=3) Đệm Độ tinh sạch (A260/A280) BN 1 BN 2 BN 3 BN 4 BN 5 Bộ đệm 1 2,00 ± 0,02 2,03 ± 0,04 2,15 ± 0,05 2,04 ± 0,08 2,03 ± 0,11 Bộ đệm 2 1,95 ± 0,05 1,97 ± 0,03 2,02 ± 0,10 1,95 ± 0,10 2,11 ± 0,05 Bộ đệm 3 2,21 ± 0,18 2,04 ± 0,07 2,03 ± 0,02 2,10 ± 0,07 2,08 ± 0,17 n=3
DNA tách chiết của 5 bệnh nhân này khi sử dụng bởi cả 3 bộ đệm sử dụng đƣợc để làm khuôn cho phản ứng PCR nhân đoạn gen Braf. Kết quả điện di sản
phẩm PCR chỉ ra rằng phản ứng PCR lấy khuôn là DNA tách chiết từ 3 bộ đệm đều nhân thành công gen đặc hiệu Braf, có kích thƣớc khoảng 252 bp, trong đó phản
ứng PCR sử dụng khuôn là DNA tách bởi bộ đệm 2 cho hiệu quả PCR tốt và ổn định ở cả 5 mẫu bệnh nhân. Kết quả này khá tƣơng đồng với kết quả đo nồng độ DNA. Hình 3.2 là kết quả điện di sản phẩm PCR của bệnh nhân 2 sử dụng 3 bộ đệm khác nhau, và kết quả cho thấy bộ đệm 2 cho băng PCR sáng và rõ nét, có độ lặp lại tốt giữa các mẫu.
Hình 3.2: Kết quả điện di PCR nhân đoạn gen Braf từ mẫu DNA của Bệnh nhân 2 tách bởi ba bộ đệm tƣơng ứng
1kb: 1kb ladder, 100bp: 100bp DNA ladder, đối chứng (+): plasmid TOPO chứa đoạn gen Braf, kích thước gen đích 252bp.
Từ kết quả trên Hình 3.1, 3.2 và Bảng 3.2 chúng tơi lựa chọn bộ đệm 2 vì bộ đệm này cho phép tách đƣợc DNA với hàm lƣợng cao nhất, có độ tinh sạch tơt và sản phẩm băng PCR nhân bản sử dụng khn DNA tách chiết đƣợc có độ sáng rõ nét, ổn định nhất giữa các lần thao tác.
3.1.2. Hạt Magsi nano phù hợp với tách chiết DNA từ mô FFPE
Sau khi lựa chọn đƣợc bộ đệm 2 là bộ đệm phù hợp nhất, dùng bộ đệm 2 để tiếp tục lựa chọn hạt Magsi nano từ 3 loại hạt Magsi nano ban đầu M1, M2, M3. Các loại hạt nano từ khác nhau ở độ dày của lớp bọc silica tạo nên đƣờng kính của hạt tăng dần từ M1 đến M3 (24,5 nm đến 34,9 nm), kích thƣớc hạt càng lớn thì từ độ bão hịa càng giảm, từ 50,2 xuống 10,3 emu/g. Vì lƣợng mơ của mỗi bệnh nhân chỉ đủ sử dụng cho khoảng 9-10 lần lặp lại, thí nghiệm lựa chọn hạt nano phù hợp buộc phải tiến hành trên mẫu mô FFPE của 5 bệnh nhân tiếp theo (ký hiệu BN 6, BN 7, BN 8, BN 9, BN 10) và mỗi bệnh nhân đƣợc lặp lại ba lần (n = 3). Nồng độ DNA khi tách chiết bởi ba loại hạt đƣợc trình bày trên Hình 3.3.
Hình 3.3: Đồ thị nồng độ DNA của 5 bệnh nhân khi tách chiết bởi ba loại hạt Magsi nano M1, M2 và M3 (n = 3)
M1: nồng độ DNA khi sử dụng hạt nano từ M1 để tách chiết, M2: nồng độ DNA khi sử dụng hạt nano từ M2 để tách chiết, M3: nồng độ DNA khi sử dụng hạt nano từ M3 để tách chiết.
0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 160,00 180,00 200,00 M 1 M 2 M 3 N ồng độ D N A ( ng/µ l) BN 6 BN 7 BN 8 BN 9 BN 10
Bảng 3.3: Kết quả đo độ tinh sạch DNA của 5 bệnh nhân tách bởi 3 loại hạt khác nhau Hạt Độ tinh sạch (A260/A280) BN 6 BN 7 BN 8 BN 9 BN 10 M 1 1,84 ± 0,03 1,93 ± 0,05 1,87 ± 0,13 2,03 ± 0,05 2,03 ± 0,02 M 2 1,83 ± 0,22 1,97 ± 0,10 1,95 ± 0,05 2,10 ± 0,04 2,08 ± 0,08 M 3 1,82 ± 0,06 1,89 ± 0,14 1,93 ± 0,08 2,08 ± 0,02 2,05 ± 0,10 n = 3
Kết quả nồng độ DNA thể hiện trên Hình 3.3 cho thấy DNA tách chiết bởi hạt M1 cho nồng độ cao nhất (34,47 ± 3,2 ng/µl ở BN 6, BN7 là 76,23 ± 5,39 ng/µl, 122,4 ± 5,5 ng/µl đối với BN 8, 173,7 ± 4,9 ng/µl BN9 và 66,7 ± 13,5 ng/µl ở BN 10) gấp 5 lần so với hạt M2 (5,67 ± 0,8 ng/µl ở BN 6, BN7 là 16,5 ± 1,18 ng/µl, 30,6 ± 5,8 ng/µl đối với BN 8, 41,6 ± 3,5 ng/µl BN9 và 12,2 ± 6,3 ng/µl ở BN 10) và gấp 2 lần so với hạt M3 (16,6 ± 1,5 ng/µl ở BN 6, BN7 là 40,5 ± 4,17 ng/µl, 69,6 ± 14,3 ng/µl đối với BN 8, 94,8 ± 1,4 ng/µl BN9 và 32,4 ± 4,5 ng/µl ở BN 10).
Độ tinh sạch của DNA tách chiết bởi ba loại hạt Magsi nano trình bày ở Bảng 3.3 cho thấy DNA tách chiết bởi cả ba loại hạt đều có độ tinh sạch tốt với giá trị A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,2 cho thấy DNA tách chiết đƣợc khá tinh sạch, không bị lẫn nhiều protein hoặc RNA.
Tiếp tục sử dụng DNA tách chiết từ ba loại hạt để làm khuôn cho phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu Braf, sau đó điện di kết quả PCR trên gel agarose
1,5% (Hình 3.4). Kết quả điện di cho thấy DNA tách chiết bởi ba loại hạt Magsi nano đều có khả năng sử dụng làm khn nhân thành cơng đoạn gen đặc hiệu Braf. Trong đó sử dụng DNA tách bởi hạt M1 cho kết quả PCR rõ nét nhất, độ dày của băng lớn nhất, tín hiệu sáng nhất so với băng PCR nhân bản từ DNA tách bởi hai loại hạt còn lại. Kết quả này tƣơng đồng với kết quả đo nồng độ DNA tổng số ở trên Hình 3.3.
Hình 3.4: Ảnh điện di kết quả PCR nhân đoạn gen Braf từ mẫu DNA của bệnh nhân 6 tách bởi ba loại hạt nano từ bọc silica
100bp: 100bp ladder, đối chứng (+): plasmid TOPO chứa đoạn gen Braf, kích thước gen đích 252bp. M1: sản phẩm PCR với khuôn là DNA sử dụng hạt M1 để tách chiết, M2: sản phẩm PCR với khuôn là DNA sử dụng hạt M2 để tách chiết, M3: sản phẩm PCR với khuôn
là DNA sử dụng hạt M3 để tách chiết.
Từ các kết quả trình bày trong Hình 3.3, 3.4 và Bảng 3.3, chúng tơi lựa chọn hạt nano từ bọc silica M1 vì hạt này cho phép tách đƣợc DNA với hàm lƣợng cao nhất và băng PCR có độ sáng rõ nét nhất.
3.1.3. DNA tách chiết từ mô FFPE phù hợp làm khuôn cho PCR và giải trình tự gen trình tự gen
Sau khi tách đƣợc DNA từ các mẫu mô FFPE của ba bệnh nhân và nhân thành công đoạn gen đặc hiệu Braf từ sản phẩm DNA tách chiết đƣợc, chúng tôi đã tiến
hành gửi mẫu giải trình tự đoạn gen Braf của hai bệnh nhân 1 và bệnh nhân 2.
Trƣớc tiên, DNA của hai bệnh nhân này sau khi tách chiết bởi hạt M1 và bộ đệm 2 đƣợc tinh sạch bởi kit ANAPURE PCR & Gel Purification (ANABIO R&D) để loại bỏ hoàn toàn protein và tạp chất đáp ứng yêu cầu để gửi mẫu đi giải trình tự ở IDT (Mỹ) thơng qua cơng ty VnDat (Việt Nam). Kết quả trình tự gen trả về đƣợc đọc bởi phần mềm tin sinh học ApE (Đại học Uta, Mỹ) và thể hiện trong Hình 3.5.
Hình 3.5: Các peak trình tự acid nucleic của một đoạn gen Braf tách từ bệnh nhân 1 (A) và bệnh nhân 2 (B)
Từ trình tự gen đƣợc phân tích bởi phần mềm ApE chúng tơi nhận thấy các tín hiệu đỉnh trình tự rõ ràng cho thấy DNA tách chiết bởi bộ đệm 2 và hạt nano từ bọc silica M1 của chúng tơi đã loại bỏ đƣợc hồn tồn các liên kết chéo, sử dụng tốt cho các thí nghiệm PCR và giải trình tự sau đó. Đồng thời qua phân tích cũng thấy đƣợc trình tự gen Braf của hai bệnh nhân này hoàn tồn trùng khớp nhau. Khi so sánh
trình tự gen Braf của hai bệnh nhân với các trình tự Braf đã công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI, chúng tơi thấy trình tự gen Braf của bệnh nhân này tƣơng đồng 100%
với trình tự gen Braf có trên nhiễm sắc thể số 7 ở ngƣời (từ nucleotit 176309-
176560). Kết quả đại diện của bệnh nhân 1 so sánh với trình tự tham chiếu đƣợc trình bày ở Hình 3.6. Nhƣ vậy là khơng có đột biến nào trong đoạn trình tự gen Braf ở 2 bệnh nhân này.
Hình 3.6: So sánh tƣơng đồng giữa trình tự DNA của đoạn gen Braf của bệnh nhân 1 (Query 1) với trình tự DNA tham chiếu của đoạn gen Braf
(Sbjct 176309) trên cơ sở dữ liệu NCBI 3.1.4. Xây dựng bộ kit tách chiết từ mơ FFPE hồn chỉnh
3.1.4.1. Quy trình tách chiết DNA từ mô FFPE sử dụng hạt magsi nano và bộ đệm pha chế
Từ những kết quả đạt đƣợc về pha chế bộ đệm phù hợp và chọn lựa hạt nano từ bọc silica phù hợp trong tách chiết DNA từ mẫu mô FFPE, chúng tôi đã xây dựng quy trình tách chiết DNA từ mẫu mơ FFPE nhƣ sau :
Xử lý mẫu trƣớc khi tách chiết
*Áp dụng với tiêu bản mô ung thư FFPE cố định trên lam kính:
- Nhúng lam kính cố định mơ vào xylen trong 5 phút để loại bỏ parafin, sau đó nhấc lam kính ra nhúng vào cồn 5 phút để loại bỏ xylen và làm sạch mẫu (lặp lại bƣớc nhúng cồn 2 lần nữa), nhấc ra nhúng vào nƣớc cất 5 phút. (chú ý các dung dịch nhúng phải ngập hết phần mơ có trên lam kính).
- Để mẫu lam kính cố định mô vào tủ 37oC trong tối đa 10 phút để mẫu khơ hồn tồn. Sau đó, thu tồn bộ lƣợng mơ trên mỗi lam kính vào 1 ống eppendorf sạch.
*Áp dụng với mẫu khối mô FFPE đúc trong thể vùi parafin:
- Mẫu mô vùi parafin đƣợc cắt thành từng lát mỏng có độ dày khoảng 1mm, dài khoảng 20-50 mm. Đầu tiên mẫu đƣợc xử lý với dung dịch dầu khoáng để loại bỏ lớp parafin. Sau đó, sử dụng cồn và nƣớc để rửa sạch lƣợng dầu khống cịn sót lại, chỉ giữ lại mô.
- Mở nắp ống và để ở nhiệt độ tối đa 37oC trong vịng 10 phút để bay hơi hồn tồn cồn.
Quy trình tách DNA từ mẫu mơ FFPE sử dụng hạt Magsi nano:
Hình 3.7: Sơ đồ tách chiết DNA từ mơ FFPE từ hạt magsi nano và bộ đệm pha chế
Thêm 200 μl LB và 20 l Proteinase K Trộn đều, ủ mẫu ở 60oC trong 60 phút
Bổ sung 400 μl BB, 200 μl isopropanol và 50 μl hạt magsi
nano
Trộn đều, ủ mẫu ở 90oC trong 60 phút
Hút loại bỏ hồn tồn dịch
Ủ nhiệt độ phịng 2-3 phút
Đặt ống lên giá nam châm để tập trung hạt từ tới