Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

Chƣơng 2 : NGUYấN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU

2.2.2.3. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

chu trỡnh nhiệt. Thành phần chớnh của phản ứng gồm cú khuụn DNA, mồi, DNA Polymerase và dNTP. Phản ứng này gồm cú ba giai đoạn chớnh:

Giai đoạn biến tớnh: Dựng nhiệt độ cao (94oC) để tỏch hai mạch của chuỗi DNA xoắn kộp.

Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ của phản ứng được hạ xuống để cỏc mồi gắn bổ

sung với sợi DNA khuụn. Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào thành phần nucleotide và chiều dài của mồi được sử dụng trong nghiờn cứu.

Giai đoạn kộo dài:Sử dụng một mạch DNA làm khuụn, DNA polymerase

tổng hợp mạch polynucleotide mới theo nguyờn tắc bổ sung. 2.2.2.4. Tinh sạch DNA bằng phương phỏp thụi gel

Sản phẩm DNA điện di trờn gel agarose được tinh sạch theo kit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche).

+ Trộn đều 100 àl sản phẩm PCR và 500 àl Binding Buffer, sau đú chuyển hỗn hợp lờn cột ly tõm bỏ dịch nổi.

+ Bổ sung 500 àl Wash Buffer, ly tõm bỏ dịch nổi + Thờm 200 àl Wash Buffer, ly tõm bỏ dịch nổi + Ly tõm tiếp loại bỏ hũan tũan Wash Buffer

+ Bổ sung 50 àl Elution Buffer, ly tõm thu sản phẩm PCR tinh sạch. 2.2.2.5. Nối ghộp cỏc đoạn DNA vào vector

Việc nối cỏc đoạn DNA vào vector được thực hiện quy trỡnh của Gene JETTM PCR Cloning Kit (Fermentas) để tạo vector tỏi tổ hợp. Phản ứng nối được thực hiện nhờ enzyme nối T4 ligase ở 160C qua đờm.

2.2.2.6. Kỹ thuật biến nạp

Cỏc vector tỏi tổ hợp được biến nạp vào tế bào vi khuẩn theo phương phỏp sốc nhiệt. Quỏ trỡnh biến nạp được thực hiện với cỏc vector: vector tỏi tổ hợp pJET

1.2 mang đoạn 5’-NK1 (kớ hiệu p5’-NK1) và pJET 1.2 mang đoạn 3’-NK1 (p3’- NK1), vector pCDNA3-NK1 và vector pEGFP- N1-NK1 mang cDNA-NK1 hoàn chỉnh.

Quỏ trỡnh biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α theo qui trỡnh trong Molecular Cloning – A Laboratory Manual gồm cỏc bước như sau:

+ Tế bào khả biến E. coli DH5α được để tan trờn đỏ. Bổ sung 10 àl hỗn hợp của phản ứng nối, bỳng nhẹ, ủ trờn đỏ 30 phỳt.

+ Sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giõy, ủ ngay trờn đỏ 3 phỳt.

+ Bổ sung 900 àl mụi trường LB, ủ 37oC trong 15 phỳt. Sau đú, dịch vi khuẩn được lắc 200 vũng/phỳt ở 37oC trong 1 giờ.

+ Trải 100 àl dịch vi khuẩn trờn đĩa thạch LB cú bổ sung Ampicillin 50 àg/ml. Đĩa được ủ ở 37oC qua đờm.

2.2.2.7. Sàng lọc khuẩn lạc

Mụ̃i khuõ̉n la ̣c mo ̣c trờn đĩa tha ̣ch LB bụ̉ sung khỏng sinh được sàng lo ̣c nhanh bằng kỹ thuõ ̣t PCR. Khuõ̉n la ̣c cho băng có kích thước phù hợp sẽ được sàng lọc tiếp bằng cỏch nuụi bóo hũa qua đờm trong mụi trường LB bổ sung khỏng sinh (Ampicillin hoặc Kanamycin ) (50 àg/ml), lắc 200 vũng/phỳt ở 370C qua đờm , tỏch plasmid và cắt kiểm tra với enzyme giới hạn .

2.2.2.8. Tỏch plasmid

Plasmid được tỏch theo qui trỡnh trong Molecular Cloning – A Laboratory Manual [201]:

+ Ly tõm thu cặn tế bào.

+ Hoà cặn trong 100 àl dung dịch I (Tris-HCl 25 mM pH 8, glucose 50 mM, EDTA 10 mM pH 8), trộn đều, ủ ở nhiệt độ phũng 5 phỳt.

+ Thờm 200 àl dung dịch II (NaOH 0,2 N, SDS 1%), đảo nhẹ, ủ trờn đỏ 3 phỳt.

+ Thờm 150 àl dung dịch III (CH3COOK 3 M pH 5,2), đảo nhẹ, ủ trờn đỏ 5 phỳt, ly tõm thu dịch trong.

+ Bổ sung 450 àl Phenol: Chloroform: Isoamyl (tỉ lệ thể tớch 25:24:1), đảo đều, ly tõm thu pha trờn.

+ Thờm 0,6 thể tớch isopropanol, đảo đều, ủ ở nhiệt độ phũng 10 phỳt, ly tõm thu tủa. Rửa tủa bằng 1 ml ethanol 70%, ly tõm thu tủa.

+ Hoà tan tủa trong 30 àl TE bổ sung RNase 20 àg/ml, ủ 37oC trong 30 phỳt. Plasmid được bảo quản ở 4oC. Mẫu plasmid được sử dụng để giải trỡnh tự. 2.2.2.9. Kĩ thuật cắt sử dụng enzyme giới hạn

Đờ̉ thiờ́t kờ́ vector tách dòng, vector biờ̉u hiờ ̣n cũng như kiờ̉m tra sự có mă ̣t của gen chuyờ̉n, DNA đươ ̣c cắt với enzyme giới ha ̣n . Thành phần của một phản ứng cắt trong tụ̉ng thờ̉ tích 15 àl được trình bày trong Bảng 8.

Bảng 8: Thành phần của một phản ứng cắt với enzyme giới hạn Thành phần Thờ̉ tích (àl)

Đờ ̣m của enzyme (10x) 1,5 àl

DNA 50 - 100 ng

Enzyme giới ha ̣n 2 - 5 Unit

H2O Vừa đủ đờ́n 15 àl

Hụ̃n hơ ̣p trờn được trụ ̣n đờ̀u, ủ ở nhiệt độ và thời gian thớch hợp với từng loại enzyme.

2.2.2.10. Kỹ thuật điện di

Điện di là phương phỏp phõn tỏch cỏc đoạn DNA cú kớch thước và cấu hỡnh khỏc nhau. Trong phõn tử DNA chứa nhúm phosphate tớch điện õm nờn trong điện trường của dũng điện một chiều, DNA sẽ di chuyển về phớa cực dương. Tốc độ di chuyển của DNA tỉ lệ nghịch với kớch thước của chỳng.

Sản phẩm của phản ứng PCR, phản ứng tinh sạch, phản ứng cắt được điện di trờn gel agarose 1%, 2% và gel polyacrylamide 8% trong đệm TBE 1X.

2.2.2.11. Phõn tớch trỡnh tự cDNA của cDNA-NK1

So sỏnh trỡnh tự cDNA-NK1 tỏch dũng từ phổi người trong vector pJET 1.2 với trỡnh tự cDNA-NK1 tỏch dũng từ nóo người của một nghiờn cứu khỏc ở Việt Nam bằng BLAST [202]. So sỏnh trỡnh tự cDNA-NK1 trong hệ thống vector biểu hiện sau khi được nhõn dũng.

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. TÁCH DềNG GEN MÃ HểA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 TỪ PHỔI NGƢỜI PHỔI NGƢỜI

3.1.1. Tổng hợp cDNA từ mẫu phổi người

RNA tổng số từ mẫu phổi tươi được tỏch chiết bằng kit AccuPrepđ Viral

RNA Extraction Kit (Bioneer). Sau đú, cDNA được tổng hợp nhờ phản ứng phiờn mó ngược sử dụng RNA tổng số và mồi hexamer. Thành phần và điều kiện của phản ứng tổng hợp cDNA được trỡnh bày trong Bảng 9.

Bảng 9: Thành phần và điều kiện phản ứng tổng hợp cDNA của gen neurokinin-1 Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện RNA tổng số 13.0 Ủ 700 trong 5’ để biến tớnh Mồi hexamer (100 àM) 1.5 dNTPs (10 mM) 2.5 Đệm 5x 5.0 - Gắn mồi: 250 trong 10 phỳt - Kộo dài: 370 trong 90 phỳt

- Bất hoạt enzyme: 850 trong 5 phỳt

AMV RTase 3.0

Tổng 25.0

Sản phẩm cDNA được bảo quản ở 4oC để sử dụng cho cỏc thớ nghiệm tiếp theo.

3.1.2. Khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1

Đoạn cDNA mó húa cho thụ thể NK1 sẽ được tỏch dũng thành hai đoạn: đoạn 5’-NK1 và đoạn 3’-NK1. Hai đoạn này sau đú sẽ được nối với nhau để tạo nờn cDNA hoàn chỉnh như sơ đồ Hỡnh 6.

Hỡnh 6: Sơ đồ khuếch đại đoạn 5’ và 3’-NK1 của gen mó húa cho neurokinin-1

Để khuếch đại đoạn 5’-NK1, chỳng tụi sử dụng cDNA được tổng hợp từ phản ứng phiờn mó ngược để làm khuụn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NK1 F/ NK1 R1. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trỡnh bày trong Bảng 10.

Bảng 10: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mó

húa cho thụ thể neurokinin-1

Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện

H2O 10.4 - Thời gian biến tớnh đầu tiờn:

94oC, 5 phỳt

- Lặp lại 45 chu kỡ:

+Biến tớnh: 940C, 30 giõy +Gắn mồi : 600C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 150 giõy

- Thời gian tổng hợp sau cựng:

720C, 10 phỳt Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F (2 àM) 0.5 NK1 R1 (2 àM) 0.5 Pfu polymerase 0.1 cDNA 1.0 Tổng 15.0

Sản phẩm PCR được điện di trờn gel agarose. Kết quả điện di cho một băng DNA cú kớch thước xấp xỉ 800 bp (Hỡnh 7). Đõy là kớch thước đỳng với tớnh toỏn cho đoạn 5’-NK1. NK1 F NK1 R NK1 R1 NK1 F1 9 4 bp 7 6 bp 9 4 bp Đoạn 5’–NK1 (788 bp) C CCGGG 7 6 bp C CCGGG Đoạn 3’- NK1 (728 bp)

Hỡnh 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1. Giếng ĐC: đối chứng õm khụng cú cDNA; Giếng 5’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY-500.

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) để chuẩn bị cho phản ứng tỏch dũng đoạn 5’-NK1 của cDNA.

3.1.3. Khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1 Tương tự như đối với đoạn 5’-NK1, chỳng tụi sử dụng cDNA làm khuụn cho phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R để khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1. Tuy nhiờn, sản phẩm PCR gồm cỏc băng DNA khụng đặc hiệu và khụng cú băng DNA với kớch thước 728 bp như mong đợi (Hỡnh 8).

Hỡnh 8: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mó húa cho

thụ thể neurokinin-1. Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY-500.

Lặp lại phản ứng nhiều lần và thay đổi cỏc điều kiện về nồng độ cDNA, nhiệt độ gắn mồi,… chỳng tụi vẫn khụng thu được băng mong muốn. Vỡ vậy, chỳng tụi quyết định thực hiện phản ứng phiờn mó ngược với mồi oligoT để tổng hợp lại cDNA từ RNA tổng số. Thành phần và điều kiện của phản ứng phiờn mó ngược được thực hiện như trong Bảng 11, chỉ thay đổi mồi hexamer bằng mồi oligoT. Sau đú, cDNA này được sử dụng làm khuụn cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’- NK1 bằng cặp mồi đặc hiệu NK1 F1/ NK1 R. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trỡnh bày trong Bảng 11.

Bảng 11: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mó

húa cho thụ thể neurokinin-1

Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện

H2O 10.4

- Thời gian biến tớnh đầu tiờn:

94oC, 5 phỳt

- Lặp lại 45 chu kỡ:

+Biến tớnh: 940C, 30 giõy +Gắn mồi : 600C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 150 giõy

- Thời gian tổng hợp sau cựng:

720C, 10 phỳt Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F1 (2 àM) 0.5 NK1 R (2 àM) 0.5 Pfu polymerase 0.1 cDNA 1.0 Tổng 15.0

Sản phẩm PCR được điện di trờn gel agarose (Hỡnh 9). Kết quả cho thấy bờn cạnh băng DNA khụng đặc hiệu thỡ đó xuất hiện băng DNA cú kớch thước lớn hơn 700 bp phự hợp với kớch thước đoạn 3’–NK1. Sử dụng kit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) chỳng tụi tinh sạch đoạn 3’-NK1.

Hỡnh 9: Điện di sản phẩm PCR dựng khuụn cDNA tổng hợp từ mồi oligo T khuếch

đại đoạn 3’-NK1. Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1, Giếng M: thang chuẩn SY-100.

3.1.4. Tỏch dũng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1

Sau khi đó tinh sạch, từng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 được đưa vào vector pJET1.2 bằng phản ứng nối sử dụng kit Gene JETTM PCR Cloning Kit (Fermentas). Thành phần của phản ứng nối được trỡnh bày trong Bảng 12.

Bảng 12: Thành phần phản ứng nối đoạn 5’-NK1 (hoặc 3’-NK1) của cDNA mó húa cho

thụ thể neurokinin-1 vào vector pJET1.2

Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện Đoạn 5’-NK1 (hoặc đoạn 3’NK1) 8.0 Hỗn hợp nối ủ ở 160Cqua đờm Đệm 2x 10.0 pJET 1.2 (50 ng/àl) 1.0 T4 ligase (5 u/ àl) 1.0 Tổng 20.0

Sau đú, từng hỗn hợp nối được biến nạp vào dũng tế bào khả biến E.coli

DH5α. Với mỗi đĩa mụi trường thạch chứa khỏng sinh để sàng lọc cỏc khuẩn lạc nhận plasmid tỏi tổ hợp, chỳng tụi chọn 8 khuẩn lạc để kiểm tra đoạn chốn bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.

Để kiểm tra đoạn chốn 5’-NK1, chỳng tụi sử dụng trực tiếp khuẩn lạc làm khuụn cho phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F/NK1 R1. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR được trỡnh bày trong Bảng 13.

Bảng 13: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chốn 5’-

NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1

Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện

H2O 10.0 - Thời gian biến tớnh đầu tiờn:

94oC, 5 phỳt

- Lặp lại 40 chu kỡ:

+Biến tớnh: 940C, 30 giõy +Gắn mồi : 600C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 150 giõy

- Thời gian tổng hợp sau cựng:

720C, 10 phỳt

Đệm 10x 1.5

dNTPs (2 mM) 1.0

NK1 F (2 àM) 0.5

NK1 R1 (2 àM) 0.5

Taq DNA polymerase (1 u/àl) 0.5

Khuụn 1.0

Tổng 15.0

Sản phẩm PCR được điện di trờn gel agarose (Hỡnh 10). Kết quả cho thấy 7 trong 8 khuẩn lạc đều cho một băng DNA cú kớch thước phự hợp với đoạn 5’-NK1. Như vậy, chỳng tụi đó tỏch dũng được đoạn 5’ –NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1. Chỳng tụi kớ hiệu bảy khuẩn lạc này lần lượt từ 5’-NK1-1 đến 5’- NK1-7.

Hỡnh 10: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc cỏc khuẩn lạc với cặp mồi NK1 F/ NK1

R1. Giếng 1-8 lần lượt là cỏc khuẩn lạc được đỏnh số tương ứng; ĐC: đối chứng õm khụng cú khuụn; M: thang chuẩn SY-500.

Tương tự như sàng lọc cỏc khuẩn lạc mang đoạn 5’–NK1, chỳng tụi chọn 8 khuẩn lạc để kiểm tra sự cú mặt của đoạn 3’-NK1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trỡnh bày trong Bảng 14.

Bảng 14: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chốn 3’-

NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1

Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện

H2O 10.0 - Thời gian biến tớnh đầu tiờn:

94oC, 5 phỳt

- Lặp lại 40 chu kỡ:

+Biến tớnh: 940C, 30 giõy +Gắn mồi : 600C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 150 giõy

- Thời gian tổng hợp sau cựng:

720C, 10 phỳt

Đệm 10x 1.5

dNTPs (2 mM) 1.0

NK1 F1 (2 àM) 0.5

NK1 R (2 àM) 0.5

Taq DNA polymerase (1 u/àl) 0.5

DNA khuụn 1.0

Tổng 15.0

Sản phẩm PCR được điện di trờn gel agarose (Hỡnh 11). Kết quả cho thấy 5 trong 8 khuẩn lạc (số 2, 4, 6, 7, 8) đều cho một băng DNA cú kớch thước phự hợp với đoạn 3’-NK1. Như vậy, chỳng tụi đó tỏch dũng thành cụng đoạn 3’–NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1. Chỳng tụi kớ hiệu năm khuẩn lạc này là 3’- NK1-1 đến 3’-NK1-5.

Hỡnh 11: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc cỏc khuẩn lạc mang đoạn chốn 3’-NK1

bằng cặp mồi NK1 F1/ NK1 R. Giếng 1-8 lần lượt là cỏc khuẩn lạc được đỏnh số tương ứng; ĐC: đối chứng õm khụng cú khuụn; M: thang chuẩn SY-500.

3.1.5. Tỏch dũng đoạn cDNA hồn chỉnh mó cho thụ thể neurokinin-1

Quỏ trỡnh tỏch dũng cDNA hồn chỉnh mó húa cho thụ thể neurokinin-1 được trỡnh bày trong Hỡnh 12.

Hỡnh 12. Sơ đồ tỏch dũng đoạn cDNA hồn chỉnh mó cho thụ thể neurokinin-1.

Đầu tiờn chỳng tụi chọn khuẩn lạc 5’-NK1-2 và 3’-NK1-6 để tỏch chiết cỏc plasmid tỏi tổ hợp mang đoạn chốn tương ứng 5’-NK1 và 3’-NK1. Plasmid này được kớ hiệu p5’-NK1-2 và p3’-NK1-6. Sử dụng p5’-NK1-2 làm khuụn cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn 5’-NK1 với mồi NK1 R1 đặc hiệu cho NK1 và mồi pJET R của vector pJET 1.2. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trỡnh bày trong Bảng 15.

Bảng 15: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại 5’-NK1 trong vector tỏi tổ

hợp p5’-NK1-2 bằng cặp mồi NK1 R1/ pJET R

Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện

H2O 10.4 - Thời gian biến tớnh đầu tiờn:

94oC, 5 phỳt

- Lặp lại 40 chu kỡ:

+Biến tớnh: 940C, 30 giõy +Gắn mồi : 600C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 120 giõy

- Thời gian tổng hợp sau cựng:

720C, 10 phỳt

Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5

dNTPs (2 mM) 1.0

NK1 R1 (2 àM) 0.5

pJET R (2 àM) 0.5

Pfu polymerase (1 u/àl) 0.1

p5’-NK1-2 1.0

Tổng 15.0

Sản phẩm PCR được điện di trờn gel agarose (Hỡnh 13). Kết quả cho thấy chỳng tụi đó khuếch đại thành cụng đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi NK1 R1/pJET R.

Hỡnh 13: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi pJET R/

NK1 R. Giếng 1: sản phẩm PCR bằng cặp mồi pJET R/NK1 R; ĐC: mẫu đối chứng õm khụng cú DNA khuụn; M: thang chuẩn SY-100.

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) và được cắt bởi hai enzyme XbaI/SmaI để chuẩn bị cho việc ghộp nối với đoạn 3’-