Chƣơng 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ
3.2.2. Tỏch dũng vector biểu hiện mang cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-
Chỳng tụi tỏch chiết và tinh sạch hai loại plasmid pCDNA3 và pEGFP-N1. Hai plasmid này và đoạn eNK1 được cắt lần lượt với enzyme HindIII. Sản phẩm cắt được điện di và tinh sạch bằng kit High Pure Product purification kit (Roche). Sau đú, sản phẩm tinh sạch tiếp tục được cắt với BamHI. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt với từng enzyme được trỡnh bày trong Bảng 20 và Bảng 21.
Bảng 20: Thành phần và điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen NK1 bằng
enzyme HindIII Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện H2O 60.0 Ủ 370Ctrong 2 giờ Đệm R 10x 15.0 eNK1(hoặc plasmid) 70.0 Hind III 5.0 Tổng 150.0
Bảng 21: Thành phần và điều kiện cho phản ứng với enzyme BamHI Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện H2O 33.0 Ủ 370Ctrong 2 giờ Đệm 10x Bam HI 10.0 Sản phẩm đó cắt với HindIII 54.0 Bam HI 3.0
Tổng 100.0
Qua mỗi bước cắt sản phẩm đều được tinh sạch bằng High Pure Product Purification kit (Roche) và được điện di kiểm tra. Kết quả cuối cựng được thể hiện trong Hỡnh 18.
Hỡnh 18: Điợ̀n di sản phõ̉m cắt vector pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK 1 với hai enzyme Hind III và Bam HI. Giếng 1, 2, 3 lõ̀n lượt là vector pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK1 khụng cắt; 1’, 2’, 3’: lõ̀n lượt là vect or pCDNA3, pEGFP-N1 và eNK1 sau khi cắt ; M1: marker 1 kb; M2: thang chuẩn SY-500.
Sau khi tinh sạch , eNK1 được đưa vào từng vector pCDNA 3 và pEGFP-N1 với thành phần được trỡnh bày trong Bảng 22.
Bảng 22: Thành phần và điều kiện của phản ứng nối cDNA mó húa cho thụ thể
neurokinin-1 vào vector pCDNA3 và pEGFP-N1
Thành phần Thể tớch(àl) Thành phần Thể tớch (àl)
Đệm 10x 2.0 Đệm 10x 2.0
eNK1cắt 8.5 eNK1 cắt 10.0
Plasmid pCDNA3 cắt 8.5 Plasmid pEGFP-N1 cắt 7.0
T4 ligase 1.0 T4 ligase 1.0
Tổng 20.0 Tổng 20.0
Điều kiện: Ủ ở 16 0C qua đờm
Hai hụ̃n hơ ̣p nụ́i được biờ́n na ̣p riờng biệt vào chủng vi khuõ̉n E. coli DH5α
mọc trờn mụi trường cú khỏng sinh ampicillin (50àg/ml). Khuẩn lạc nhận plasmid pEGFP-N1 sẽ mọc trờn mụi trường cú khỏng sinh Kanamycin (50àg/ml). Trờn cả hai loại mụi trường , chỳng tụi thu được nhiều khuẩn lạc . Để sàng lo ̣c khuõ̉n la ̣c mang cDNA hồn chỉnh mó húa cho NK1, chỳng tụi chọn 14 khuẩn lạc trờn mụi trường chứa khỏng sinh ampicillin và 15 khuẩn lạc trờn mụi trường chứa khỏng sinh kanamycin làm khuụn cho phản ứng PCR với că ̣p mụ̀i NK 1 F3/ NK1 R3. Thành phõ̀n và điều kiện phản ứng được thờ̉ hiờ ̣n trong Bảng 23.
Bảng 23: Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR kiểm tra cDNA-NK1 trong cỏc thể
biến nạp
Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện
H2O 10.0 - Thời gian biến tớnh đầu tiờn:
94oC, 5 phỳt
- Lặp lại 40 chu kỡ:
+Biến tớnh: 940C, 30 giõy +Gắn mồi : 600C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 135 giõy
- Thời gian tổng hợp sau cựng:
720C, 10 phỳt
Đệm 10x 1.5
dNTPs (2 mM) 1.0
NK1 F3 (10 àM) 0.5
NK1 R3 (10 àM) 0.5
Taq DNA polymerase (1 u/ àl) 0.5
Khuụn 1.0
Tổng 15.0
Sản phẩm PCR được điện di trờn gel agarose (Hỡnh 19 và Hỡnh 20). Kết quả cho thấy với cỏc dũng vi khuẩn mang vector tỏi tổ hợp pCDNA3, chỳng tụi đó thu được 8 trong 15 khuẩn lạc mang đoạn chốn cDNA-NK1 cú kớch thước như mong muốn (Hỡnh 19).Với cỏc dũng chứa vector tỏi tổ hợp peGFP-N1, chỳng tụi thu được 13 trong 15 khuẩn lạc chứa đoạn chốn cDNA-NK1 cú kớch thước mong muốn (Hỡnh
20).
Hỡnh 19: Điợ̀n di sản phõ̉m PCR kiờ̉m tra khuõ̉n la ̣c mang vector tái tụ̉ hợp
pCDNA3-NK1. Giờ́ng 1A-14A: cỏc khuẩn lạc được đỏnh số tương ứng ; giếng M: thang chuẩn SY-500.
Hỡnh 20: Điợ̀n di sả n phõ̉m PCR kiờ̉m tra khuõ̉n la ̣c mang vector tái tụ̉ hợp pGFPN1-NK1. Giờ́ng 1E-15E: cỏc khuẩn lạc được đỏnh số tương ứng ; giếng M: thang chuẩn SY-500.
Như vậy chúng tụi đã tách dòng được hai vector tái tụ̉ hợp pCDNA 3-NK1 và pEGFPN1-NK1 mang cDNA hồn chỉnh mó cho NK 1. Dựa vào ảnh điện di , chỳng tụi lựa chọn hai khuẩn lạc 11A và 5E. Cỏc vector tỏi tổ hợp của hai khuẩn lạc này được kớ hiệu là pCDNA 3-NK1-11 và pEGFP -N1-NK1-5. Chỳng tụi tỏch chiết hai loại plasmid tỏi tổ hợp để giải trình tự.