Chƣơng 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-
3.1.2. Khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1
Đoạn cDNA mã hóa cho thụ thể NK1 sẽ được tách dòng thành hai đoạn: đoạn 5’-NK1 và đoạn 3’-NK1. Hai đoạn này sau đó sẽ được nối với nhau để tạo nên cDNA hồn chỉnh như sơ đồ Hình 6.
Hình 6: Sơ đồ khuếch đại đoạn 5’ và 3’-NK1 của gen mã hóa cho neurokinin-1
Để khuếch đại đoạn 5’-NK1, chúng tôi sử dụng cDNA được tổng hợp từ phản ứng phiên mã ngược để làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NK1 F/ NK1 R1. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 10.
Bảng 10: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã
hóa cho thụ thể neurokinin-1
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện
H2O 10.4 - Thời gian biến tính đầu tiên:
94oC, 5 phút
- Lặp lại 45 chu kì:
+Biến tính: 940C, 30 giây +Gắn mồi : 600C, 30 giây +Tổng hợp: 720C, 150 giây
- Thời gian tổng hợp sau cùng:
720C, 10 phút Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F (2 µM) 0.5 NK1 R1 (2 µM) 0.5 Pfu polymerase 0.1 cDNA 1.0 Tổng 15.0
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose. Kết quả điện di cho một băng DNA có kích thước xấp xỉ 800 bp (Hình 7). Đây là kích thước đúng với tính tốn cho đoạn 5’-NK1. NK1 F NK1 R NK1 R1 NK1 F1 9 4 bp 7 6 bp 9 4 bp Đoạn 5’–NK1 (788 bp) C CCGGG 7 6 bp C CCGGG Đoạn 3’- NK1 (728 bp)
Hình 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Giếng ĐC: đối chứng âm khơng có cDNA; Giếng 5’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY-500.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) để chuẩn bị cho phản ứng tách dòng đoạn 5’-NK1 của cDNA.
3.1.3. Khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Tương tự như đối với đoạn 5’-NK1, chúng tôi sử dụng cDNA làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R để khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Tuy nhiên, sản phẩm PCR gồm các băng DNA khơng đặc hiệu và khơng có băng DNA với kích thước 728 bp như mong đợi (Hình 8).
Hình 8: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho
thụ thể neurokinin-1. Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY-500.
Lặp lại phản ứng nhiều lần và thay đổi các điều kiện về nồng độ cDNA, nhiệt độ gắn mồi,… chúng tơi vẫn khơng thu được băng mong muốn. Vì vậy, chúng tơi quyết định thực hiện phản ứng phiên mã ngược với mồi oligoT để tổng hợp lại cDNA từ RNA tổng số. Thành phần và điều kiện của phản ứng phiên mã ngược được thực hiện như trong Bảng 11, chỉ thay đổi mồi hexamer bằng mồi oligoT. Sau đó, cDNA này được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’- NK1 bằng cặp mồi đặc hiệu NK1 F1/ NK1 R. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 11.
Bảng 11: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã
hóa cho thụ thể neurokinin-1
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện
H2O 10.4
- Thời gian biến tính đầu tiên:
94oC, 5 phút
- Lặp lại 45 chu kì:
+Biến tính: 940C, 30 giây +Gắn mồi : 600C, 30 giây +Tổng hợp: 720C, 150 giây
- Thời gian tổng hợp sau cùng:
720C, 10 phút Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F1 (2 µM) 0.5 NK1 R (2 µM) 0.5 Pfu polymerase 0.1 cDNA 1.0 Tổng 15.0
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 9). Kết quả cho thấy bên cạnh băng DNA khơng đặc hiệu thì đã xuất hiện băng DNA có kích thước lớn hơn 700 bp phù hợp với kích thước đoạn 3’–NK1. Sử dụng kit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) chúng tơi tinh sạch đoạn 3’-NK1.
Hình 9: Điện di sản phẩm PCR dùng khuôn cDNA tổng hợp từ mồi oligo T khuếch
đại đoạn 3’-NK1. Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1, Giếng M: thang chuẩn SY-100.
3.1.4. Tách dịng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1
Sau khi đã tinh sạch, từng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 được đưa vào vector pJET1.2 bằng phản ứng nối sử dụng kit Gene JETTM PCR Cloning Kit (Fermentas). Thành phần của phản ứng nối được trình bày trong Bảng 12.
Bảng 12: Thành phần phản ứng nối đoạn 5’-NK1 (hoặc 3’-NK1) của cDNA mã hóa cho
thụ thể neurokinin-1 vào vector pJET1.2
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện
Đoạn 5’-NK1 (hoặc đoạn 3’NK1)
8.0
Hỗn hợp nối ủ ở 160Cqua đêm
Đệm 2x 10.0
pJET 1.2 (50 ng/µl) 1.0 T4 ligase (5 u/ µl) 1.0
Tổng 20.0
Sau đó, từng hỗn hợp nối được biến nạp vào dòng tế bào khả biến E.coli
DH5α. Với mỗi đĩa môi trường thạch chứa kháng sinh để sàng lọc các khuẩn lạc nhận plasmid tái tổ hợp, chúng tôi chọn 8 khuẩn lạc để kiểm tra đoạn chèn bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Để kiểm tra đoạn chèn 5’-NK1, chúng tôi sử dụng trực tiếp khuẩn lạc làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F/NK1 R1. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR được trình bày trong Bảng 13.
Bảng 13: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 5’-
NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện
H2O 10.0 - Thời gian biến tính đầu tiên:
94oC, 5 phút
- Lặp lại 40 chu kì:
+Biến tính: 940C, 30 giây +Gắn mồi : 600C, 30 giây +Tổng hợp: 720C, 150 giây
- Thời gian tổng hợp sau cùng:
720C, 10 phút
Đệm 10x 1.5
dNTPs (2 mM) 1.0
NK1 F (2 µM) 0.5
NK1 R1 (2 µM) 0.5
Taq DNA polymerase (1 u/µl) 0.5
Khn 1.0
Tổng 15.0
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 10). Kết quả cho thấy 7 trong 8 khuẩn lạc đều cho một băng DNA có kích thước phù hợp với đoạn 5’-NK1. Như vậy, chúng tơi đã tách dịng được đoạn 5’ –NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Chúng tơi kí hiệu bảy khuẩn lạc này lần lượt từ 5’-NK1-1 đến 5’- NK1-7.
Hình 10: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc với cặp mồi NK1 F/ NK1
R1. Giếng 1-8 lần lượt là các khuẩn lạc được đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng âm khơng có khn; M: thang chuẩn SY-500.
Tương tự như sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn 5’–NK1, chúng tôi chọn 8 khuẩn lạc để kiểm tra sự có mặt của đoạn 3’-NK1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 14.
Bảng 14: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-
NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện
H2O 10.0 - Thời gian biến tính đầu tiên:
94oC, 5 phút
- Lặp lại 40 chu kì:
+Biến tính: 940C, 30 giây +Gắn mồi : 600C, 30 giây +Tổng hợp: 720C, 150 giây
- Thời gian tổng hợp sau cùng:
720C, 10 phút
Đệm 10x 1.5
dNTPs (2 mM) 1.0
NK1 F1 (2 µM) 0.5
NK1 R (2 µM) 0.5
Taq DNA polymerase (1 u/µl) 0.5
DNA khuôn 1.0
Tổng 15.0
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 11). Kết quả cho thấy 5 trong 8 khuẩn lạc (số 2, 4, 6, 7, 8) đều cho một băng DNA có kích thước phù hợp với đoạn 3’-NK1. Như vậy, chúng tơi đã tách dịng thành cơng đoạn 3’–NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Chúng tơi kí hiệu năm khuẩn lạc này là 3’- NK1-1 đến 3’-NK1-5.
Hình 11: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1
bằng cặp mồi NK1 F1/ NK1 R. Giếng 1-8 lần lượt là các khuẩn lạc được đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng âm khơng có khn; M: thang chuẩn SY-500.
3.1.5. Tách dịng đoạn cDNA hồn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1
Quá trình tách dịng cDNA hồn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 được trình bày trong Hình 12.
Hình 12. Sơ đồ tách dịng đoạn cDNA hồn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1.
Đầu tiên chúng tôi chọn khuẩn lạc 5’-NK1-2 và 3’-NK1-6 để tách chiết các plasmid tái tổ hợp mang đoạn chèn tương ứng 5’-NK1 và 3’-NK1. Plasmid này được kí hiệu p5’-NK1-2 và p3’-NK1-6. Sử dụng p5’-NK1-2 làm khuôn cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn 5’-NK1 với mồi NK1 R1 đặc hiệu cho NK1 và mồi pJET R của vector pJET 1.2. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 15.
Bảng 15: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại 5’-NK1 trong vector tái tổ
hợp p5’-NK1-2 bằng cặp mồi NK1 R1/ pJET R
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện
H2O 10.4 - Thời gian biến tính đầu tiên:
94oC, 5 phút
- Lặp lại 40 chu kì:
+Biến tính: 940C, 30 giây +Gắn mồi : 600C, 30 giây +Tổng hợp: 720C, 120 giây
- Thời gian tổng hợp sau cùng:
720C, 10 phút
Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5
dNTPs (2 mM) 1.0
NK1 R1 (2 µM) 0.5
pJET R (2 µM) 0.5
Pfu polymerase (1 u/µl) 0.1
p5’-NK1-2 1.0
Tổng 15.0
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 13). Kết quả cho thấy chúng tôi đã khuếch đại thành cơng đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi NK1 R1/pJET R.
Hình 13: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi pJET R/
NK1 R. Giếng 1: sản phẩm PCR bằng cặp mồi pJET R/NK1 R; ĐC: mẫu đối chứng âm khơng có DNA khn; M: thang chuẩn SY-100.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) và được cắt bởi hai enzyme XbaI/SmaI để chuẩn bị cho việc ghép nối với đoạn 3’- NK1. Tiếp theo, chúng tôi cũng tiến hành cắt vector tái tổ hợp p3’-NK1-6 với hai enzyme XbaI/ SmaI. Thành phần phản ứng cắt được trình bày trong Bảng 16.
Bảng 16: Thành phần cắt và điều kiện cho phản ứng cắt với hai enzyme XbaI/SmaI Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện H2O 42.0 Ủ 370C trong 2 giờ Đệm Tango 10x 6.0 p3’-NK1-2 (hoặc sản phẩm PCR đoạn 5’-NK1) 8.0 SmaI 2.0 XbaI 2.0
Các sản phẩm cắt với hai enzyme được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8% (Hình 14A). Kết quả cho thấy phản ứng cắt được thực hiện hoàn toàn; các băng DNA được cắt có kích thước theo đúng tính tốn. Băng DNA có kích thước 700 bp của đoạn 5’-NK1 và băng DNA có kích thước 3341 bp gồm plasmid pJET và đoạn 3’-NK1 được tinh sạch bằng kit của QIAquick Gel
Extraction (QIAGEN) rồi điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8% (Hình 14B). Kết quả cho thấy hai băng DNA đã tinh sạch đảm bảo cho phản ứng nối tiếp theo.
Hình 14: Điện di sản phẩm cắt trước và sau khi tinh sạch bằng kit QIAquick Gel
Extraction (QIAGEN). A: sản phẩm cắt trước khi tinh sạch; B: sản phẩm cắt sau khi tinh sạch; 1: sản phẩm PCR chứa đoạn 5’-NK1 sau khi cắt; 2: sản phẩm vector p3’-NK1-6 cắt; M: thang chuẩn-100; M1: thang chuẩn 1 kb.
Đoạn 5’-NK1 và vector có chứa đoạn 3’-NK1 được nối với nhau theo thành phần trình bày trong Bảng 17.
Bảng 17:Thành phần phản ứng nối đoạn 5’-NK1 vào vector pJET1.2-3’-NK1 Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện Đệm 2x 10.0 Ủ 160C qua đêm 5’-NK1 5.0 p3’-NK1-6 4.0 T4 ligase 1.0 Tổng 20.0
Sau đó, hỗn hợp nối được biến nạp trực tiếp vào dòng vi khuẩn E.coli DH5α theo phương pháp trình bày trong mục 2.2.2.6. Kết quả trên môi trường chọn lọc bổ sung kháng sinh có nhiều khuẩn lạc. Chúng tơi chọn 13 khuẩn lạc để kiểm tra sự có mặt của đoạn cDNA hoàn chỉnh bằng phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F/ NK1 R. Đây là hai mồi bắt cặp với trình tự ở đầu 5’ và đầu 3’ của cDNA hoàn chỉnh mã cho
9
thụ thể neurokinin-1. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR được trình bày trong Bảng 18.
Bảng 18: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc chứa đoạn cDNA
hồn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện
H2O 10.0 - Thời gian biến tính đầu tiên:
94oC, 5 phút
- Lặp lại 40 chu kì:
+Biến tính: 940C, 30 giây +Gắn mồi : 600C, 30 giây +Tổng hợp: 720C, 150 giây
- Thời gian tổng hợp sau cùng:
720C, 10 phút
Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5
dNTPs (2 mM) 1.0
NK1 F (2 µM) 0.5
NK1 R (2 µM) 0.5
Taq DNA polymerase (1u/ µl) 0.5
Khn 1.0
Tổng 15.0
Hình 15: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn cDNA NK1
hoàn chỉnh. Giếng1-13 là các khuẩn lạc được đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng âm khơng có DNA; M: thang chuẩn 1 kb.
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy chúng tôi đã thu được 10 trong số 13 khuẩn lạc mang đoạn chèn có kích thước xấp xỉ 1338 bp như mong đợi. Các khuẩn lạc này được kí hiệu NK1-1 đến NK1-10.
3.1.6. Giải trình tự cDNA hịan chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1
Chúng tôi chọn khuẩn lạc NK1-3 để tách plasmid tái tổ hợp. Plasmid này được kí hiệu pNK1-3. Plasmid pNK1-3 được giải trình tự hai chiều bằng mồi của vector pJET 1.2 F/ R. Kết quả được trình bày trong Phụ lục.
Kết quả khi so sánh với trình tự nucleotide của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 được tách dịng từ não người Việt Nam, chúng tơi khơng thấy bất kỳ sự sai khác nào. Cả hai trình tự này đều có 5 nucleotide khác với trình tự trong ngân hàng dữ liệu (Mã số trên NCBI: M81797.1). Điều này chứng tỏ rằng sự khác biệt giữa trình tự nucleotide trong gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 của người Việt Nam với trình tự nucleotide trong ngân hàng dữ liệu là do tính đa hình của gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người.
Như vậy, từ kết quả giải trình tự cho thấy chúng tơi đã tách dịng thành cơng cDNA hồn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ mẫu phổi người Việt Nam.
3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 NEUROKININ-1
3.2.1. Thiết kế mồi
Để biểu hiện cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người, chúng tôi sử dụng hai vector biểu hiện ở tế bào động vật là pCDNA3 và pEGFP-N1. Bước đầu tiên cần chuyển đoạn cDNA đã tách dòng trong vector pJET1.2 sang hai hệ thống vector biểu hiện. Khi lựa chọn enzyme cắt giới hạn, chúng tôi không thấy enzyme nào trong vị trí đa điểm của vector pEGFP-N1 và pCDNA3 thỏa mãn điều kiện cắt văng ra đoạn cDNA hồn chỉnh từ vector tái tổ hợp pJET1.2-NK1. Vì vậy, chúng tôi đã thiết kế mồi NK1 F3/ NK1 R3 để chuyển cDNA-NK1 từ pNK1-3 sang vector biểu hiện. Trình tự cặp mồi NK1 F3/ NK1 R3 được thiết kế dựa vào trình tự cDNA hồn chỉnh tách dịng từ phổi người Việt Nam. Trong đó ở đầu 5’ của mồi NK1 F3
được thiết kế mang trình tự nhận biết cho enzyme cắt giới hạn HindIII và mồi NK1 F3 mang trình tự nhận biết cho enzyme BamHI như Hình 16.
+ NK1 F3: 5’- - 3’
+ NK1 R3: 5’- - 3’
Hình 16: Sơ đồ thiết kế mồi NK1 F3/R3 để khuếch đại cDNA-NK1 từ vector
pNK1-3.
Mặt khác, chúng tơi sử dụng mã mở đầu trong trình tự cDNA của NK1 thay vì mã mở đầu được thiết kế sẵn trên vector biểu hiện nên trong quá trình thiết kế mồi chúng tôi phải chèn thêm trình tự Kozak (ACCATGG) vào để làm tăng khả năng được phiên mã và dịch mã của gen trong tế bào nhận.
Với hai mồi được thiết kế mới, chúng tôi khuếch đại cDNA từ pNK1-3. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR được thể hiện trong Bảng 19.
Bảng 19: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại cDNA-NK1 từ pNK1-3 bằng
cặp mồi NK1 F3/ NK1 R3
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện
H2O 10.4
- Thời gian biến tính đầu tiên: 94oC, 5 phút
- Lặp lại 4 chu kì:
+Biến tính: 940C, 30 giây
Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5
dNTPs (2 mM) 1.0
G T T AC A C GA GAGG A T C C CT AGG AAT