CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Các phương pháp xác định đột biến gen ty thể
1.3.5. Một số phương pháp khác
Kéo dài mồi dựa trên đánh dấu huỳnh quang sử dụng VentR (exo-) DNA polymerase để loa ̣i trừ sự hình thành heteroduplex cũng là một trong các phương pháp được dụng trong phát hiện đột biến điểm. Các DNA homoduplex đươ ̣c đánh dấu và phân cắt b ằng enzyme giới hạn, phân tách trên máy giải trình tự DNA tự đô ̣ng. Tỷ lệ mtDNA đô ̣t biến được xác đi ̣nh theo mâ ̣t đô ̣ huỳnh quang của các đoạn DNA đột biến và không đô ̣t biến.
Kỹ thuật SSCP (Single-Stranded Conformational Polymorphism) với nguyên tắc là trong điều kiện điện di khơng biến tính, các mạch đơn DNA sẽ có một cấu trúc nhất định tùy theo trình tự của nó. Cấu hình này được xác định bởi các liên kết nội phân tử. Các cấu hình sẽ khác nhau ngay cả khi chỉ khác biệt một nucleotide. Sự khác biệt này dẫn đến sự khác biệt về khả năng di chuyển trong gel polyacrylamide. Phương pháp này có thể áp dụng để sàng lọc đột biến điểm chưa biết ở bê ̣nh nhân nghi ngờ rối loa ̣n mtDNA, đi ̣nh lượng mtDNA đô ̣t biến. Đầu tiên, thực hiện PCR để khuếch đa ̣i đoa ̣n DNA xung quanh vị trí đột biến (khoảng 200- 350 bp, tốt nhất DNA kích thước khoảng 150 bp) với một mồi có gắn phóng xạ (đánh dấu dATP-P32 hoặc huỳnh quang) và một mồi khơng gắn phóng xạ để tạo nên đoạn DNA sợi kép ngắn. Sản phẩm PCR được biến tính thành sợi đơn và phân tách bằng điện di trên gel polyacrylamide không biến tính . Gel này cho phép các sợi đơn tái tạo lại cấu trúc, hình thành cấu trúc thứ cấp khác nhau. Những mảnh DNA sợi đơn khác nhau sẽ hình thành tập hợp những cấu trúc thứ cấp và chính vì thế tạo nên kiểu băng điện di khác nhau trên gel . Phân tích tự đô ̣ng bằng điê ̣n di ma o quản hoă ̣c bằng autoradiography . Trình tự khác nhau làm thay đổi cấu trúc DNA, do đó các băng mang đô ̣t biến được phân biê ̣t bởi sự di trú khi điê ̣n di . So sánh với đối chứng, xác định trình tự nucleotide.
Chip DNA hoặc DNA microarray là một kỹ thuật mới để phát hiện các đột biến đặc hiệu với tốc độ rất nhanh, chính xác dựa trên cơ sở phân tích đột biến bằng
vi tính. Để sản xuất các chip DNA, các oligonucleotide đóng vai trị của các đoạn dị (probe) được máy cài lên một phiến kính nhỏ. Mỗi phiến kính như vậy với diện tích khoảng 1 cm2 có thể chứa từ hàng trăm đến hàng ngàn loại oligonucleotide khác nhau. Các oligonucleotide này gồm các DNA có trình tự bình thường và các DNA có trình tự mang các đột biến gây bệnh đã biết. DNA của một đối tượng nào đó được gắn huỳnh quang và cho lai với các oligonucleotide trên phiến kính để xác định xem chúng lai với oligonucleotide bình thường hay đột biến. Mẫu lai được phân tích trên máy vi tính để xác định DNA của đối tượng là bình thường hay mang loại đột biến cụ thể nào.
Các phương pháp đánh dấu bao gồm gắn trực tiếp chất đánh dấu vào đích bằng phản ứng của các nhóm hoạt động hố học, PCR với mồi đánh dấu hoặc dùng enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích. Các chất chỉ thị phát hiện có thể là chất phát huỳnh quang (Cy3/Cy5 (cyanine), streptavidin /phycoerythrin), chất phóng xạ (32P,
33P, 35S), chất phát quang hoá học (Chemilumi-nescent) như digoxigenein, biotin, và nhuộm vàng/bạc. Trong đó, Cy3/Cy5 được sử dụng rộng rãi nhất. Cy3 là một chất nhuộm huỳnh quang tan trong nước thuộc họ cyanine có bước sóng kích thích/bước sóng phát huỳnh quang cực đại là 550/570 nm. Cy3 thường được tổng hợp với các nhóm phản ứng ở một hoặc cả hai vị trí của nitơ để có thể tương tác với cả axit nucleic lẫn protein
Năm 2009, Du và cộng sự [14] đã thử nghiệm biochip trên 7 bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng được chẩn đoán MELAS, 5 bệnh nhân MERRF, 1 trường hợp nghi nghờ MERRF và 25 người khỏe mạnh. Sử dụng DNA khuôn gắn chất huỳnh quang Cy5, sau đó khuếch đại bằng PCR, rồi tiến hành lai với mẫu dò-31 mẫu dò được thiết kế để sàng lọc 31 loại đột biến điểm gây nên MELAS và MERRF, mỗi cặp mẫu dò cụ thể cho một đột biến nhất định có trình tự giống hệt ngoại trừ một nucleotide thay thế nằm gần giữa trình tự. Các tín hiệu huỳnh quang từ tất cả các điểm trên biochip được bắt giữ bởi một đầu đọc tín hiệu huỳnh quang (GenePix 4000B, Axon Instruments, Inc.) tại bước sóng 635 nm cho Cy5 và phân tích bởi phần mềm GenePix Pro 4.0. Kết quả cho thấy tất cả bệnh nhân chẩn đốn MELAS có đột biến A3243G trên tARNLeu (heteroplasmy), trong những bệnh nhân MERRF có 4 trường hợp là đột biến A8344G trên tARNLys
(homoplasmy), 1 trường hợp T8356C trên tARNLys (heteroplasmy). Không ai trong số người khỏe mạnh mang những đột biến này.