CHƢƠNG II : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.8 .Nhân dòng sản phẩm PCR vào vector pGEM-T
Plasmid vector pGEM-T được mở vòng sẵn với gốc T ở 2 đầu cho việc gắn các sản phẩm PCR mang gốc A (do Taq DNA polymerase gắn thêm vào). Vector pGEM-T có kích thước 3.015 bp, mang gen Ampr, gen lacZ, MCS và promoter đặc trưng cho các RNA polymerase (SP6, T7) ở hai bên vùng MCS cho phép phiên mã đoạn DNA gắn trong vector. Ưu điểm của vector này là có kích thước nhỏ, có mặt của gen lacZ’ rất thuận tiện cho việc phát hiện vector tái tổ hợp, vùng MCS cho
phép chèn vào gần như bất kỳ một trình tự DNA lạ nào.
Các sản phẩm PCR được nhân lên bằng Taq DNA polymerase sau khi được kiểm tra trên gel agarose 2%, được gắn vào vector pGEM-T.
Bảng 8: Thành phần phản ứng gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector pGEM-T STT Thành phần phản ứng Thể tích STT Thành phần phản ứng Thể tích 1 Đệm T4 DNA ligase 2X 5 µl 2 Vector pGEM-T 1 µl 3 T4 DNA ligase 1 µl 4 Sản phẩm PCR 2 µl
5 Nước cất loại ion, vơ trùng 1 µl
Tổng thể tích 10 µl
Phản ứng nối ghép xảy ra ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ hoặc 4oC qua đêm. Sau đó, được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α và nuôi cấy trên môi trường thạch LB có chứa ampicillin ở nồng độ 50 µg/ml với X-gal ở nồng độ 20 mg/ml và IPTG tương ứng là cơ chất và chất cảm ứng của β-galactosidase. Các tế bào được nuôi cấy ở 37oC qua đêm và được sàng lọc về sự có mặt của gen ngoại lai bằng PCR.
Để biến nạp plasmid vào tế bào khả biến E. coli DH5, tế bào khả biến được để trên đá 10-20 phút. Sau đó, 10 µl hỗn hợp gắn giữa vector và DNA đích được bổ sung vào dung dịch tế bào, hỗn hợp được trộn nhẹ và để trên đá 20 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào, và chuyển nhanh hỗn hợp vào bể ổn nhiệt 420C trong 45 giây, hỗn hợp sau đó được làm lạnh ngay lên đá 2 phút. 300 l môi trường LB lỏng được bổ sung vào hỗn hợp biến nạp. Mẫu sau đó được ni cấy tĩnh trong tủ ấm 37oC trong 10 phút và tiếp đến nuôi lắc ở tốc độ 150 rpm, 370C trong 50 phút. 50-100 l hỗn hợp biến nạp được cấy trải tế bào trên đĩa petri chứa môi
trường LB đặc có chứa 5 g/ml, 20 µl X-gal 2 mg/ml và 20 µl IPTG 100 mM và nuôi trong tủ ấm 370C qua đêm.
Các khuẩn lạc E. coli DH5α tạo thành được kiểm tra bằng phương pháp PCR trực tiếp. Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp sẽ được chọn lọc và nuôi trong môi trường LB lỏng, chuẩn bị cho bước tách plasmid.
Nhờ có gen lacZ trong vector nên khi tế bào vật chủ mang plasmid và trong mơi trường có cơ chất X-gal cũng như chất cảm ứng IPTG thì tạo thành các khuẩn lạc màu xanh da trời. Cơ sở của quá trình hình thành màu xanh da trời là do gen
lacZ mã hóa cho β-galactosidase có khả năng phân giải được cơ chất X-gal thành β-
galactose và hợp chất 5-bromo-4-chloro indolyl. Hợp chất này tác dụng với oxy trong khơng khí và chuyển thành 5,5’-dibromo-4,4’-dichloro indigo có màu xanh da
trời. IPTG là chất cảm ứng của gen lacZ, vì vậy trong mơi trường có IPTG và X- gal, các khuẩn lạc có chứa vector nguyên bản sẽ có màu xanh. Còn các khuẩn lạc với các tế bào mang vector tái tổ hợp có gen chèn vào vị trí gene lac Z sẽ có màu
trắng (do gen lacZ bị bất hoạt), nên trên mơi trường có X-gal và IPTG sẽ chỉ cho
khuẩn lạc màu trắng. Căn cứ vào màu của khuẩn lạc trên mơi trường ni cấy có ampicillin, Xgal và IPTG người ta có thể nhận ra các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp. Sau đó khuẩn lạc trắng được lựa chọn để nuôi trong môi trường LB lỏng qua đêm nhằm trẻ hóa tế bào, từ đó tạo nguyên liệu cho bước tách plasmid.