1 2 3 4
Đường chạy 1: Thang
chuẩn DNA 1 kb; 2, 3, 4: plasmid tinh sạch gia đình bệnh nhân III.
Tuy nhiên, trình tự đoạn gen của bệnh nhân và người mẹ chỉ có độ tương đồng 95,3% so với trình tự chuẩn tương ứng của hệ gen ty thể công bố trên GenBank, do mất đi 9 nucleotide CCCCCTCTA so với trình tự chuẩn, ngồi ra có sự sai khác một nucleotide (C thay cho A ở vị trí 184 trong đoạn gen được nhân lên) do cách thiết kế mồi ban đầu của chúng tôi.
Dưới đây là một phần trình tự tự nucleotide và tín hiệu huỳnh quang thu được từ máy CEQ8000 khi xác định trình tự mẫu gia đình bệnh nhân III.
A. Bố Bệnh nhân
Hình 18: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen bệnh nhân, mẹ bệnh nhân và bố bệnh nhân gia đình III với trình tự chuẩn hệ gen ty thể công bố trên GenBank
B. Mẹ Bệnh nhân
C. Bệnh nhân
Hình 19: Kết quả xác định trình tự của đoạn gen đích của gia đình III (A, B, C)
Như vậy, kết quả giải trình tự đoạn DNA (8155-8366) trên hệ gen ty thể hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích bằng PCR-RFLP. Tuy nhiên, việc xác định trình tự giúp chúng tơi khẳng định chính xác đoạn nulcleotide bị mất.
Áp dụng phương pháp đã nêu ở trên (PCR-RFLP kết hợp với việc xác định trình tự, chúng tơi đã phát hiện 23 trường hợp mất đoạn 9 bp (Bảng 10, Phụ lục 2) trong tổng số 72 mẫu nghiên cứu, chiếm tỷ lệ 31,9~32%.
Bảng 10: Danh sách bệnh nhân bị đột biến mất đoạn 9 bp
STT Bệnh nhân Ghi chú STT Bệnh nhân
1 Nguyễn Đình N.
Gia đình I
7 Phạm Thanh H.
Nguyễn Đình Nh. 8 Nguyễn Thị Phương N. Đỗ Thị Gi. 9 Đào Thái S.
2 Hồng Thị Như Q.
Gia đình II
10 Vũ Qúy M. Hoàng Văn T. 11 Đỗ Trường P. Nguyễn Thị H. 12 Lê Doãn Xuân Tr. 3 Lê Mai L.
Gia đình III
13 Trần Thanh B. Bùi Thị D. 14 Trần An N. Lê Xuân S. 15 Hà Việt H. 4 Nguyễn Thị T.
Gia đình IV
16 Trần Đình Việt D. Nguyễn Mạnh H. 17 Phạm Nhật Q. Nguyễn Hồng Đ. 18 Đinh Viê ̣t N. 5 Nguyễn Văn Đ.
Gia đình V
19 Ngũn Văn T. Ngơ Thị Ng. 20 Nguyễn Kim H. Nguyễn Minh Đ. 21 Nguyễn Hoàng A. Nguyễn Văn Đi. 22 Trần Văn H. 6 Nguyễn Thị Phương Kh. Gia đình VI 23 Nguyễn Mạnh D. Nguyễn Thành Đ. Nguyễn Đức Th. Lê Thị K.
Như vậy tần suất xuất hiện sự mất đoạn 9 bp giữa vùng COII và tRNALys ở các bệnh nhân Việt Nam nghi ngờ hội chứng cơ não ty thể là tương đối cao so với những người khỏe mạnh (chiếm tỷ lệ 20%) như được báo cáo trong nghiên cứu trước đây [18]. Kết quả này phần nào cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu về tần suất xuất hiện sự mất đoạn 9 bp trong hệ gen ty thể ở các bệnh nhân người Đài Loan mắc hội chứng MELAS và MERRF là 47% so với người khỏe mạnh là 21% [22].
Các nghiên cứu trước đây cũng đã cho rằng có sự thiếu ổn định của vùng gen COII/tRNALys trong hệ gen ty thể ở các bệnh nhân bị bệnh ty thể và là điểm nóng cho sự mất đoạn [33], mặc dầu vùng này của ty thể vốn được xem là một vùng khơng mã hóa cho protein hay enzyme nào. Do đó, có thể nó khơng phải là một đột biến gây nên bệnh tật. Nhưng tỷ lệ đột biến mất đoạn cao trong những bệnh nhân có biểu hiện rối loạn hoạt động ty thể, khiến chúng tôi nhận định hai khả năng: thứ nhất, ở bệnh nhân bị rối loạn hoạt động ty thể thì quá trình sao chép của gen ty thể bị lỗi và gây ra sự mất đoạn, đặc biệt ở những vùng trình tự lặp lại tương đồng; thứ hai, sự mất đoạn này ở người đã góp phần cho những biểu hiện bệnh đa dạng của bệnh ty thể.
3.3. Phân tích đột biến A3243A
3.3.1. Nhân đoạn gen mang đột biến A3243G
Nhằm tìm hiểu sự liên quan giữa đột biến mất đoạn 9 bp với đột biến A3243G của hội chứng MELAS, chúng tơi đã tiến hành sàng lọc sự có mặt của đột biến này ở 72 bệnh nhân mà chúng tôi chọn điều tra đột biến mất đoạn 9 bp và đột biến A8344G nêu trên.
Đột biến thay thế A thành G ở vị trí 3243 làm xuất hiện trình tự nhận biết của enzyme HaeIII (AGCC → GGCC). Chúng tôi đã áp dụng phương pháp PCR-RFLP như được nêu trong nghiên cứu của Trịnh Lê Phương và tập thể [3].
Cặp mồi đặc hiệu trên (MtFw và MtRv) chứa hai vị trí nhận biết của enzyme
HaeIII và ở mồi xi 3149C được thay bằng 3149T cịn ở mồi ngược 3318G được
thay bằng 3318A (so với trình tự gốc). Với cách thiết kế như trên, cặp mồi đã loại bỏ hai trình tự nhận biết của HeaIII trong sản phẩm PCR. Vì vậy, chỉ những đoạn DNA chứa đột biến mới có vị trí nhận biết của enzyme HaeIII và bị cắt thành hai
đoạn mới, cịn đoạn DNA khơng chứa đột biến thì khơng có vị trí nhận biết của enzyme HaeIII nên khơng bị cắt và giữ ngun kích thước ban đầu. Theo tính tốn lý thuyết, PCR với cặp mồi thiết kế chúng tôi nhân bản được đoạn DNA từ vị trí 3134 đến vị trí 3331, kích thước 198 bp.
Chúng tơi sử dụng chế phẩm DNA tổng số tách từ mẫu máu của các bệnh nhân cho PCR. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% ở hình 20 cho thấy sản phẩm PCR từ các mẫu DNA tổng số tách từ máu của các bệnh nhân đều cho một băng DNA duy nhất có kích thước như tính tốn lý thuyết là 198bp. Trong khi đó, sản phẩm PCR của mẫu khơng có DNA không cho băng DNA nào cả.
198bp
1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 20: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
Đường chạy 1: Thang chuẩn
DNA 100 bp, 2: Đối chứng âm (khơng có khn DNA), 3→8: Sản phẩm PCR với DNA khuôn từ một số bệnh nhân.
3.3.2. Phát hiện đột biến A3243G bằng PCR-RFLP
Sau khi kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2%, chúng tôi đã tiến hành cắt trực tiếp các sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn HaeIII, sản phẩm của phản ứng cắt giới hạn được điện di trên gel polyacrylamide 15% và thu được kết quả điện di ở hình 21.
Theo lý thuyết, enzyme HaeIII cắt đoạn DNA kích thước 198 bp chứa đột
biến A3243G thành hai đoạn mới có kích thước 111 bp và 87 bp. Cịn đoạn DNA không chứa đột biến không bị enzyme HaeIII cắt và giữ nguyên kích thước ban đầu 198 bp. Dựa vào phổ băng DNA thu được chúng ta có thể kết luận đoạn DNA có mang đột biến hay không.
Đối chứng dương được cắt từ DNA khuôn bệnh nhân bị đột biến A3243G xác định trong nghiên cứu Trịnh Lê Phương và tập thể [3] sau khi cắt bằng HaeIII đều cho 3 băng DNA là 198 bp, 111 bp và 87 bp. Đột biến này đã được nhóm nghiên cứu giải trình tự và khẳng định phương pháp xác định đột biến A3243G bằng PCR-RFLP là hồn tồn chính xác.