Từ kết quả phân tích trong hình , sau nhiều lần lặp lại thí nghiệm, mẫu chứng dương cho kết quả là những đường cong vượt tín hiệu nền, cịn mẫu chứng âm cho kết quả là các đường cong khơng vượt qua tín hiệu nền. Qua phân tích kết quả, tại nồng mẫu dị 300nM kết quả ln ổn định và cho đường cong đồ thị cao nhất. Do đó, chúng tơi chọn làm nồng độ tối ưu cho các lần khảo sát kế tiếp.
3.6 Khảo sát nồng độ Mg++
Ion Mg2+ cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng tới kết quả phản ứng. Nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq DNA polymerase bị ức chế. Ngược lại, nếu nồng độ Mg2+ quá cao sẽ không cho sản phẩm khuếch đại hoặc cho sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Ở một nồng độ tối ưu, ion này làm tăng khả năng bắt cặp của mồi vào bản mẫu và hoạt động kéo dài của Taq DNA polymerase, tạo sự kết hợp chặt chẽ giữa các dNTP. Trong thí nghiệm khảo sát nồng độ Mg2+ tối ưu cho các phản ứng, chỉ có nồng độ Mg2+ là thay đổi còn các điều kiện phản ứng như nhiệt độ lai tối ưu, nồng độ mồi, mẫu dò tối ưu vẫn được giữ nguyên.
3.6.1 Khảo sát nồng độ Mg++
phản ứng 1
300nM
Dựa vào kết quả trong hình 3.27, tại các nồng độ Mg2+ được khảo sát, mẫu chứng không mang đột biến đều cho kết quả âm tính, cịn mẫu chứng dương mang đột biến kháng isoniazid đều cho kết quả tín hiệu dương tính. Tại nồng độ Mg2+ là 3,0mM, mẫu chứng dương cho tín hiệu mạnh nhất. Sau khi lặp lại thí nghiệm nhiều lần, chứng dương đều cho kết quả ổn định và mạnh nhất tại nồng độ Mg2+ là 3,0mM. Do vậy, chúng tơi chọn nó làm nồng độ tối ưu.
3.6.2 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 2
Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ trong phản ứng 2 được thể hiện trong hình 3.28. Căn cứ vào kết quả từ hình 3.29, trong tất cả các nồng độ Mg2+ được khảo sát, mẫu chứng không mang đột biến Rifampin đều cho kết quả âm tính, mẫu chứng dương mang đột biến kháng Rifampin tại gen rpoB vị trí 516 đều cho kết quả
dương tính.
Hình 3.28: Kết quả khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 2
Tại nồng độ Mg2+ là 3,0mM, mẫu chứng dương cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị cao nhất và ổn định qua nhiều lần khảo sát. Do đó, chúng tơi chọn nó làm giá trị nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng 2
3.6.3 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 3
Hình 3.29: Kết quả khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 3
3.0mM
Căn cứ vào kết quả từ hình 3.29, trong tất cả các nồng độ Mg2+ được khảo sát, mẫu chứng không mang đột biến kháng ethambutol đều cho kết quả âm tính, mẫu chứng amplicon mang đột biến kháng ethambutol tại gen emb vị trí 306 (A→G) đều cho kết quả dương tính. Tại nồng độ Mg2+ là 2,5mM, mẫu chứng dương cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị cao nhất và ổn định qua nhiều lần khảo sát. Do đó, chúng tơi chọn 2,5mM làm giá trị nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng 3.
3.6.4 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 4
Hình 3.30: Kết quả khảo sát nồng độ Mg++
phản ứng 4
Căn cứ vào kết quả từ hình 3.30, trong tất cả các nồng độ Mg++ được khảo sát, mẫu chứng không mang đột biến kháng ethambutol đều cho kết quả âm tính, mẫu chứng amplicon mang đột biến kháng ethambutol tại gen vịt trí 306 (G→A) đều cho kết quả dương tính. Tại nồng độ Mg2+ là 3.0mM, mẫu chứng dương cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị cao nhất và ổn định qua nhiều lần khảo sát. Do đó, chúng tơi chọn 3.0mM làm giá trị nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng 4.
3.7 Khảo sát độ lặp lại của phản ứng
Tính biến động của phản ứng real-time PCR là một yếu tố rất quan trọng, chính điều này có thể làm sai lệch kết quả. Trên cùng một mẫu bệnh phẩm, kết quả thu được có thể khác nhau giữa các lần thí nghiệm, cũng như giữa các phịng thí nghiệm khác nhau. Khả năng gây ra sự khác biệt này có thể là do thao tác của người tiến hành, sự biến động của các thành phần hóa chất trong phản ứng hoặc do sự
MTB DNA… Để đánh giá độ lặp lại của phản ứng real-time PCR, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại trong cùng một lần thí nghiệm (intra-assay) và độ lặp lại giữa các lần thí nghiệm khác nhau (inter-assay). Các phản ứng được thực hiện trên các điều kiện tối ưu đã được khảo sát.
3.7.1 Khảo sát độ lặp lại trong cùng một lần thí nghiệm
Để đánh giá độ lặp lại trong một thí nghiệm, chúng tôi thực hiện phản ứng trên các mẫu dương đột biến tại gen katG vị trí 315, rpoB vị trí 516, emb vị trí 306
(A→G)và emb vị trí 306 (G→A) ở các nồng độ 104 và 103 bản sao/ml. Mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần trong cùng một lần thí nghiệm.
3.7.1.1 Khảo sát độ lặp lại trong một lần thí nghiệm đối với phản ứng 1
Hình 3.31: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phản ứng 1
MTB DNA (bản sao/ml)
Ct(Threshold cycle) Trung
bình Độ lệch chuẩn biến thiên Hệ số
Lần 1 Lần 2 Lần 3
104 27,5 28 28,3 27,9 0,4 0,01
103 32,8 32,8 33,5 33,3 0,4 0,001
Bảng 3.10: Bảng chi tiết kết quả khảo sát về độ lặp lại của phản ứng 1
Kết quả từ hình và bảng cho thấy phản ứng 1có tính lặp lại cao, hệ số biến thiên nội phản ứng có giá trị thấp hơn 1%. Như vậy phản ứng rất ổn định với các chỉ
Lần 1
Lần 2
3.7.1.2 Khảo sát độ lặp lại trong một lần thí nghiệm đối với phản ứng 2
Kết quả từ hình 3.32 và bảng 3.11 cho thấy phản ứng 2 có tính lặp lại cao, giá trị biến thiên nội phản ứng có giá trị thấp hơn 1%.
Hình 3.31: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phản ứng 2
MTB DNA (bản sao/ml)
Ct(Threshold cycle) Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến thiên Lần 1 Lần 2 Lần 3 104 28,9 29,3 29,5 29,2 0,305 0,01 103 32,8 33 33 32,9 0,11 0,003
Bảng 3.11: Bảng chi tiết kết quả khảo sát về độ lặp lại của phản ứng 2
3.7.1.3 Khảo sát độ lặp lại trong một lần thí nghiệm đối với phản ứng 3
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3
MTB DNA (bản sao/ml)
Ct(Threshold cycle) Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến thiên Lần 1 Lần 2 Lần 3 104 28,8 29 29.1 28,9 0,15 0,005 103 32,8 33,1 33 32,9 0,15 0,004
Bảng 3.12: Bảng chi tiết kết quả khảo sát về độ lặp lại của phản ứng 3
Kết quả từ hình 3.32 và bảng 3.12 cho thấy phản ứng 3 có tính lặp lại cao, giá trị biến thiên nội phản ứng có giá trị thấp hơn 1%.
3.7.1.4 Khảo sát độ lặp lại trong một lần thí nghiệm của phản ứng 4
Hình 3.33: Kết quả khảo sát độ lặp lại phản ứng 4
Hình 3.34: kết quả khảo sát độ lặp lại của phản ứng 4
MTB DNA (bản sao/ml)
Ct(Threshold cycle) Trung
bình Độ lệch chuẩn biến thiên Hệ số
Lần 1 Lần 2 Lần 3
104 29 29 29.1 29,03 0,05 0,001
103 32 32 33,5 32.5 0,86 0,02
Bảng 3.13: Bảng chi tiết kết quả khảo sát độ lặp lại phản ứng
Lần 1 Lần 2
3.7.2 Khảo sát độ lặp lại của các phản ứng trong các lần thí nghiệm khác nhau
3.7.2.1 Phản ứng 1- phát hiện đột biến kháng isoniazid
Hình 3.34 : Độ lặp lại giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 1
MTB DNA (bản sao/ml)
Ct(Threshold cycle) Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến thiên Lần 1 Lần 2 Lần 3 104 27,5 28 27,8 27,7 0,25 0,009 103 31 31,5 31 31,1 0,28 0,009
Bảng 3.14: Hệ số biến thiên giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 1
Từ hình 3.34 và bảng 3.14 cho thấy phản ứng real-time PCR phát hiện đột biến kháng isoniazid tại gen katG vị trí 315 có hệ số biến thiên < 2%. Như vậy phản ứng có tính lặp lại cao giữa các lần thí nghiệm.
Lần 3
3.7.2.2 Phản ứng 2- phát hiện đột biến kháng Rifampin
Hình 3.35: Độ lặp lại giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 2
MTB DNA (bản sao/ml)
Ct(Threshold cycle) Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến thiên Lần 1 Lần 2 Lần 3 104 27,5 27 27,8 27,4 0,4 0,014 103 32 33 32,5 32,5 0,5 0,01
Bảng 3.15: Hệ số biên thiên giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 2
Từ hình 3.35 và bảng 3.15 cho thấy phản ứng real-time PCR phát hiện đột biến kháng Rifampin tại gen katG vị trí 315 có hệ số biến thiên < 2%. Như vậy phản ứng có tính lặp lại cao giữa các lần thí nghiệm.
Lần 1 Lần 2
3.7.2.3 Phản ứng 3 – xác định đột biến kháng ethambutol (ATG→GTG, Met→Val)
Từ hình 3.36 và bảng 3.16 cho thấy phản ứng real-time PCR phát hiện đột biến kháng ethambutol tại gen emb vị trí 306 (ATG→GTG, Met→Val) có hệ số biến thiên < 2%. Như vậy phản ứng có tính lặp lại cao giữa các lần thí nghiệm.
Hình 3.36: Độ lặp lại giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 3
MTB DNA (bản sao/ml)
Ct(Threshold cycle) Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến thiên Lần 1 Lần 2 Lần 3 104 29 28,3 28 28,4 0,5 0,018 103 32 33 32,5 32,5 0,5 0,01
Bảng 3.16: Hệ số biến thiên giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 3
Lần 1 Lần 2
3.7.2.4 Phản ứng 4 – xác định đột biến kháng ethambutol (ATG→ATA, Met→Ile)
Hình 3.37: Độ lặp lại giữa 3 lần thí nhiệm của phản ứng 4
MTB DNA (bản sao/ml)
Ct(Threshold cycle) Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến thiên Lần 1 Lần 2 Lần 3 104 28 28,3 28 28,1 0,17 0,006 103 32 32,5 32,5 32,3 0,028 0,008
Bảng 3.17: Hệ số biến thiên giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 4
Từ hình 3.37 và bảng 3.17 cho thấy phản ứng real-time PCR phát hiện đột biến kháng ethambutol tại gen emb vị trí 306 (ATG→GTG, Met→Val) có hệ số biến thiên < 2%. Như vậy phản ứng có tính lặp lại cao giữa các lần thí nghiệm.
Lần 3
Lần 2 Lần 1
3.8 Khảo sát độ nhạy của phản ứng
Độ nhạy của phản ứng real-time PCR là khả năng phát hiện đột biến trong quần thể. Dung dịch MTB DNA sau khi được pha loãng thành nhiều nồng độ bậc 10 liên tiếp được sử dụng để khảo sát độ nhạy. Độ nhạy của phản ứng tương ứng với nồng độ mẫu chứng dương đột biến thấp nhất cho kết quả dương tính.
3.8.1 Phản ứng 1- xác định đột biến kháng isoniazid
Hình 3.38: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng
Nồng độ MTB DNA (copies/ml) Màu phát huỳnh quang Threshold Cycle Ct 101 FAM - 102 FAM 37,5 103 FAM 34 104 FAM 31 105 FAM 27 106 FAM 23 107 FAM 18
Bảng 3.18: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng 1
Từ kết quả của hình 3.38 và bảng 3.18 cho thấy đối với nồng độ 101 phản ứng cho kết quả âm tính, từ nồng 102
trở lên đều dương tính. Sau nhiều lần khảo sát cho
107 copies/ml 106 copies/ml 105 copies/ml 104 copies/ml 103 copies/ml 102 copies/ml 101 copies/ml
3.8.2 Phản ứng 2- xác định đột biến kháng Rifampin
Hình 3.39: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng 2
Nồng độ MTB DNA (copies/ml) Màu phát huỳnh quang Threshold Cycle Ct 101 FAM - 102 FAM 37,5 103 FAM 33 104 FAM 30 105 FAM 24.2 106 FAM 20.5 107 FAM 16.5
Bảng 3.19: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng 2
Từ kết quả của hình 3.39 và bảng 3.19 cho thấy đối với nồng độ 101 phản ứng cho kết quả âm tính, từ nồng 102
trở lên đều dương tính. Sau nhiều lần khảo sát cho
107copy/ml 106copy/ml 105copy/ml 104copy/ml 103copy/ml 102copy/ml 101copy/ml
3.8.3 Phản ứng 3 và phản ứng 4- xác định đột biến kháng ethambuton
(ATG→GTG, Met→Ala) và (ATG→ATA, Met→Ile)
Thí nghiệm này chúng tơi thực hiện đồng thời trên cả hai phản ứng đối với đột biến kháng ethambutol. Từ kết quả của hình 3.40 và bảng 3.20 cho thấy đối với nồng độ 101 phản ứng cho kết quả âm tính, từ nồng 102 trở lên đều dương tính. Sau nhiều lần khảo sát cho thấy ngưỡng phát hiện của phản ứng là 102copies/ml.
Hình 3.40: Kết quả khảo sát độ nhạy phản ứng 3 và 4
: emb306 Mut ATGGTG
: : emb306 Mut ATGATA
107copy/ml 106copy/ml 105copy/ml 104copy/ml 103copy/ml 102copy/ml 101copy/ml
Nồng độ MTB DNA (copies/ml) Màu phát huỳnh quang Threshold Cycle Ct Phản ứng 3- xác định đột biến kháng ethambutol (ATG→GTG) 101 FAM - 102 FAM 36.5 103 FAM 32 104 FAM 28.5 105 FAM 25 106 FAM 21 107 FAM 17 Phản ứng 4 – xác định đột biến kháng ethambutol (ATG→ATA) 101 FAM - 102 FAM 36 103 FAM 32 104 FAM 28.5 105 FAM 25 106 FAM 21 107 FAM 17.5
Bảng 3.20: Kết quả khảo sát độ nhạy phản ứng 3 và 4
3.9 Khảo sát độ đặc hiệu của các phản ứng
Để đảm bảo các cặp mồi và mẫu dò được sử dụng trong các phản ứng real- time PCR phát hiện đột biến kháng isoniazid, Rifampin và ethambutol là đặc hiệu đối với MTB, các phản ứng real-time PCR giữa các cặp mồi và mẫu dò thiết kế cùng với DNA tách chiết của một số đối tượng vi sinh vật khác (CMV, EBV, HCV, HPV, HBV) sẽ được thiết lập. Các mẫu DNA này đã được xác định dương tính với bộ kit chẩn đốn do Cơng ty Cổ phần Cơng nghệ Việt Á cung cấp.
Hệ primer, mẫu dò được xem là đặc hiệu đối với các đột biến kháng thuốc của MTB sẽ cho kết quả dương tính với mẫu chứng dương và cho kết quả âm tính với mẫu chứng âm và các chủng vi sinh vật khác.
3.9.1 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 1- xác định đột biến kháng isoniazid
Chúng tôi sử dụng mẫu VA315 đã được xác định đột biến kháng isoniazid bằng phương pháp giải trình tự làm chứng dương. Kết quả mẫu VA315 đường tín hiệu lên cao vượt tín hiệu nền, các mẫu chứng dương với CMV, EBV, HCV, HPV, HBV đều cho kết quả âm tính. Như vậy primer và mẫu dị thiết kế đặc hiệu với MTB.
Hình 3.41: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu phản ứng 1
3.9.2 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 2- xác định đột biến kháng Rifampin
Hình 3.42: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 2
Chúng tôi sử dụng mẫu VA516 đã được xác định đột biến kháng Rifampin bằng phương pháp giải trình tự làm chứng dương. Kết quả mẫu VA516 đường tín hiệu lên cao vượt tín hiệu nền, các mẫu chứng dương với CMV, EBV, HCV, HPV, HBV đều cho kết quả âm tính. Như vậy primer và mẫu dị thiết kế đặc hiệu với MTB.
VA315 +CMV +EBV +HCV +HPV +HBV VA516 +CMV +EBV +HCV +HPV +HBV
3.9.3 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 3 và 4 - xác định đột biến kháng ethambutol ethambutol
Hình 3.43: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 3 và 4
Thí nghiệm này chúng tôi thực hiện luôn với cả hai phản ứng xác định đột biến kháng ethambutol. Mẫu chứng dương VA306GA và VA306AG đã được xác định có đột biến kháng thuốc với ethambutol được Công ty Cổ phần Công Nghệ Việt Á cung cấp. Kết quả 2 mẫu đột biến ethambutol đều cho kết quả tốt, mẫu dương tính với CMV, EBV, HPC, HCV và HBV đều cho kết quả âm tính, chứng tỏ mẫu không bị nhiễm trong quá trình thao tác và hệ mồi và mẫu dò đặc hiệu với MTB. +CMV +EBV +HCV +HPV +HBV VA306GA VA306AG
3.10 Quy trình phát hiện đột biến kháng isoniazid, Rifampin và ethambutol của MTB. 3.10.1 Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt 3.10.1 Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt * Thành phần phản ứng Thành phần Phản ứng 1 Xác định đột biến kháng isoniazid Phản ứng 2 Xác định đột biến kháng Rifampin Phản ứng 3 Xác định đột biến kháng ethambutol(ATG GTG) Phản ứng 4 Xác định đột biến kháng ethambutol(ATG ATA) PCR Master Mix (ul) 12,5 12,5 12,5 12,5 Mồi xuôi (nM) 300 300 300 300 Mồi ngược(nM) 300 300 300 300