Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.3. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)

 Chuẩn bị hóa chất:

 Đệm SSC (Saline – sodium citrate buffer) 20X: Hòa tan 87,6 gam sodium chloride và 44,1 gam sodium citrate trong 450 ml nước cất, thêm nước đến đủ 500 ml, chuẩn pH bằng HCl cho đến khi đạt pH 7.

 Đệm SSC 2X.

 Dung dịch RNase nồng độ 100 µg/ml pha trong SSC 2X.

 Ethanol lạnh ở các nồng độ 70%, 80%, 90%, 95%, 100%.

 Hybridization Buffer: formamide 50% (v/v), SDS 0,1% (w/v), dextran sulfate 10% (w/v), đầu dị 5 ng/µl, ADN sợi đơn tinh trùng cá hồi 300 ng/ml, pha trong SSC 2X.

 Wash Buffer: formamide 20% (v/v) pha trong SSC 0,1X.

 Detection Buffer: Tween 20 nồng độ 0,2% (v/v) pha trong SSC 4X.

 Blocking Buffer: BSA 5% (w/v) pha trong Detection Buffer.

 Dung dịch HCl 10mM.

 Pepsin 40 U/ml pha trong HCl 10 mM.

 DAPI 2 µg/ml pha trong PBS.

 Xử lý tế bào trước khi lai:

 Thu tế bào bằng cách xử lý trypsin và ly tâm, huyền phù hóa trong PBS với nồng độ cuối cùng là 2x106 tế bào/ml.

 Chuyển huyền phù tế bào lên lam kính đã xử lý ethanol (20 µl huyền phù/lam), trải đều tế bào lên diện tích khoảng 20x20 mm trên lam.

 Định hình bằng dung dịch cố định (methanol và acetic acid với tỷ lệ tương ứng 3:1) trong 1 phút, để khô tự nhiên.

 Rửa hai lần qua SSC 2X, mỗi lần 5 phút.

 Xả nhanh qua HCl 10 mM.

 Ủ lam kính với 200 μl pepsin trong 10 phút ở 37oC.

 Xả nhanh qua nước cất khử ion.

 Loại nước bằng dãy nồng độ cồn 70%, 80%, 90%, 95% (mỗi lần 2 phút) và 100% (5 phút).

 Để khô bằng cách đưa vào tủ ấm 60oC trong 60 phút, hoặc để qua đêm ở nhiệt độ phòng.

 Tiến hành lai:

 Biến tính Hybridization Buffer ở 70oC trong 10 phút, chuyển nhanh lên đá.

 Chuyển 15µl dung dịch lai lên vị trí cần lai trên lam kính, đậy lamen nhựa, gắn keo để tránh bay hơi dung dịch.

 Biến tính lam ở 70oC trong 5 phút.

 Lai ở 65oC qua đêm, lắc trên máy lắc với tốc độ 50 vòng/phút.

 Hạ dần nhiệt độ xuống 37oC, để ổn định mẫu ở 37oC trong 1 giờ.

 Phát hiện

 Rửa lam qua SSC 2X để loại bỏ lamen nhựa.

 Rửa hai lần bằng Wash Buffer ở 40oC, mỗi lần 5 phút.

 Rửa lần lượt qua SSC 0,1X và 2X ở 40oC, mỗi lần 10 phút.

 Đưa lam kính về nhiệt độ phịng.

 Cân bằng tiêu bản trong Detection Buffer với thời gian 5 phút.

 Ủ lam với Blocking Buffer trong 20–30 phút.

 Rửa lại bằng SSC 2X trong 5 phút.

 Nhuộm DAPI trong 10 phút.

 Rửa lại bằng cách xả từ từ qua PBS.

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. TỔNG HỢP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR