(ĐC) Mẫu đối chứng; (TN) mẫu chuyển gen E110–F2. Nhân tế bào được nhuộm với DAPI
bắt màu xanh lam. Các vị trí bắt cặp đặc hiệu giữa đầu dị đánh dấu Alexa Fluor® 568 và ADN đích có màu đỏ (vị trí mũi tên).
Tín hiệu huỳnh quang thu được thể hiện ở Hình 23. Nhân tế bào bắt màu với thuốc nhuộm DAPI có màu xanh lam. Ở mẫu thí nghiệm có những tế bào chứa vị trí ADN trong nhân tế bào bắt cặp với đầu dò cho tín hiệu huỳnh quang màu đỏ. Kết quả này cho thấy mẫu thí nghiệm đã được phát hiện gen chuyển IL–6 bằng đầu dị
đặc hiệu gắn Alexa Fluor® 568, đồng thời gen đã được đưa vào nhân tế bào. Có thể dễ dàng nhận thấy các vị trí này phát tín hiệu với cường độ khơng đồng đều, ngun nhân có thể giải thích do số lượng Alexa Fluor® 568–5–dUTP được gắn vào các đầu dị khơng giống nhau.
3.4. THẢO LUẬN
Trong thời gian gần đây, gà chuyển gen là đối tượng nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trong ứng dụng sản xuất các protein tái tổ hợp. Nhiều sinh phẩm có nguồn gốc từ người đã được nghiên cứu tạo ra trên gà với mục đích ứng dụng điều trị bệnh, như hormone FSH, kháng thể đơn dòng miR24, interferon β–1a, interferon α–2a ,… [28, 52]. Ở Việt Nam, ứng dụng công nghệ chuyển gen trên động vật là hướng nghiên cứu còn mới mẻ, những kết quả đạt được còn rất hạn chế do yêu cầu đầu tư về kỹ thuật và cơ sở vật chất. Các thành tựu về gà chuyển gen mới chỉ được cơng bố bởi nhóm nghiên cứu của cố GS. TS. Nguyễn Mộng Hùng và TS. Nguyễn Lai Thành (ĐH Khoa học Tự nhiên – ĐHQG Hà Nội). Đề tài khoa học trọng điểm cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển gen tạo ra động vật sản xuất protein dược liệu” đã thu được những thành công bước đầu trong việc ứng dụng một số phương pháp chuyển gen trên gà để tạo ra protein tái tổ hợp ở lòng trắng trứng [2, 10]. So với phương pháp thông qua tinh trùng và vi tiêm trực tiếp ADN vào đĩa phôi giai đoạn X, tạo gà chuyển gen dựa trên tế bào gốc phơi có ưu điểm là lựa chọn được biến đổi di truyền không gây hại từ trước khi tạo thành cơ thể khảm, do đó tiết kiệm thời gian cũng như chi phí cho q trình tạo dịng [25].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập và nhân nuôi cESCs từ đĩa phôi giai đoạn X. Những tế bào này thể hiện những đặc điểm hình thái đặc trưng khi ni cấy in vitro: tế bào tròn với nhân lớn, liên kết không chặt chẽ với nhau tạo thành quần lạc tương tự như ESCs ở nhiều lồi động vật có vú khác. Ngun bào sợi thai chuột cũng được sử dụng để làm lớp tế bào ni, đây là loại tế bào có khả năng hỗ trợ ESCs tăng sinh khơng biệt hóa trong thời gian dài. Hiện nay cESCs đã được duy
trì qua 28 ngày ni cấy với 3 lần cấy chuyển mà vẫn giữ được những đặc điểm đặc trưng của tế bào gốc đa tiềm năng.
Khi nghiên cứu biến đổi di truyền cESCs cần chú ý đến các hệ thống vector đủ mạnh để chuyển gen mong muốn với hiệu suất cao và duy trì ổn định trong cơ thể vật chủ. Trước đây, chúng tôi đã thử nghiệm sử dụng các kỹ thuật vật lý (xung điện) và hóa chất (Lipofectamine™ 2000) để chuyển gen EGFP vào cESCs, trong đó gen chuyển đã được phát hiện trong tế bào bằng phản ứng PCR, cũng như biểu hiện thành sản phẩm phát huỳnh quang màu xanh lá cây (kết quả chưa công bố). Tuy nhiên, hiệu suất thu được khá thấp, đồng thời xung điện ảnh hưởng lớn tới sức sống và sự sinh trưởng của tế bào. Ngồi ra, q trình sàng lọc trong thời gian dài ảnh hưởng tới khả năng hội nhập của những tế bào này khi tiêm vào phôi nhận (người ta chưa ghi nhận trường hợp nào cESCs nuôi cấy quá một tuần có khả năng tạo cơ thể khảm dịng sinh dục [51]). Trong nghiên cứu này, vector được sử dụng là pLenti6/V5–DEST (có nguồn gốc lentivirus) đã chèn gen IL–6 người. Đây là vector có khả năng chuyển gen cao và ổn định đối với cESCs, tất cả các mẫu cESCs được chuyển nhiễm đều dương tính với phản ứng PCR, đồng thời gen chuyển vẫn được phát hiện trong những mẫu đã trải qua gần 30 ngày nuôi cấy với 3 lần cấy chuyển. Ngồi ra, chúng tơi đã tiêm những tế bào này vào phôi nhận, kết quả phân tích PCR cho thấy gen ngoại lai vẫn được duy trì trong cơ thể gà con [6]. Bên cạnh đó, thực nghiệm cho thấy vector này khá an tồn khi sử dụng, ít ảnh hưởng tới tế bào, đồng thời là những vector tái bản thiếu nên không tạo thành virus có hại. Vì vậy, đây thực sự là công cụ chuyển gen đầy tiềm năng.
Để tạo gà chuyển gen, quá trình sàng lọc tế bào biến đổi di truyền như mong muốn đóng vai trị rất quan trọng. Gen chuyển cần được cài vào ADN trong nhân tế bào để có thể truyền lại cho thế hệ sau, đồng thời phải được duy trì bền vững qua nhiều thế hệ cơ thể. Hơn nữa, gen ngoại lai phải nằm ở vị trí thích hợp: trong vùng ADN hoạt động, nhưng không được chèn vào giữa gen cấu trúc hay các vùng ADN giữ chức năng điều hịa,... Thực tế, chúng tơi đã vi tiêm những tế bào trên vào phôi nhận, tuy nhiên kết quả thu được rất hạn chế: phôi thường chết ở giai đoạn sớm của
q trình phát triển, chỉ có khoảng 10% trong số đó nở thành gà con, nguyên nhân có thể do những lý do trên, khiến sức sống của phôi bị ảnh hưởng [6] (xem thêm Phụ lục 3).
Để xác định vị trí gen chuyển trong cESCs, chúng tơi lựa chọn sử dụng kỹ thuật FISH. Nó có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, đặc hiệu và tốc độ tiến hành khá nhanh, nên trở thành trở thành công cụ hữu hiệu trong các nghiên cứu cơ bản cũng như chẩn đoán và điều trị [12, 37]. Sử dụng kỹ thuật FISH ở kỳ trung gian của quá trình ngun phân, chúng tơi đã phát hiện được gen IL–6 trong nhân tế bào thơng
qua tín hiệu huỳnh quang quan sát được dưới kính hiển vi. Phát triển từ nghiên cứu này, chúng tôi đang thử nghiệm thực hiện phản ứng lai ở kỳ giữa nguyên phân nhằm xác định vị trí chính xác của gen chuyển trên nhiễm sắc thể cESCs. Thành công của hướng đi này sẽ tạo tiền đề cho việc dự đốn ảnh hưởng của vị trí chèn gen chuyển tới các gen chức năng khác trong tế bào, từ đó có thể sàng lọc được những tế bào mong muốn để tiêm vào phôi nhận tạo gà khảm.
Tuy nhiên, khi thực hiện phản ứng FISH, hiệu quả chúng tôi thu được không cao. Trong tổng số 10 mẫu cESCs dương tính với phản ứng PCR được phân tích, chỉ có hai mẫu cho kết quả mong muốn (tín hiệu huỳnh quang rõ nét, khơng có nhiễu nền kể cả ở mẫu đối chứng). Một số nguyên nhân đã được đưa ra để giải thích cho vấn đề này. Đầu dị có kích thước tương đối lớn (gần 300 bp), gắn thêm các phân tử phát huỳnh quang Alexa Fluor® 568 cấu trúc khá cồng kềnh (Hình 4) làm giảm khả năng bắt cặp với ADN đích. Thao tác rửa lam sau quá trình phản ứng nhằm loại bỏ sự không đặc hiệu được thực hiện khá nghiêm ngặt, trong đó có sử dụng chất gây biến tính mạnh (formamide) có thể làm mất một phần những phức hệ lai mong muốn. Trong thời gian tới, chúng tôi tiếp tục tối ưu hóa điều kiện thực hiện phản ứng FISH, cũng như cải thiện đầu dò (đánh giá số lượng phân tử huỳnh quang được gắn vào để giảm kích thước đầu dò, tổng hợp đầu dò mạch đơn,…) nhằm nâng cao hiệu quả phân tích.
Mặc dù vậy, đề tài đã đạt được những thành cơng đáng khích lệ. Đây là lần đầu tiên ở Việt Nam khi sử dụng kỹ thuật FISH, đầu dò huỳnh quang được tổng hợp ngay tại phịng thí nghiệm bằng phương pháp PCR. Sử dụng phương pháp này, nghiên cứu viên có thể chủ động tổng hợp được bất cứ loại đầu dị cho trình tự ADN đã biết nào đó, khơng bị bó hẹp trong phạm vi một gen hay một trình tự nhất định. Kết quả nghiên cứu cũng góp phần triển khai áp dụng và tiếp tục phát triển nhiều kỹ thuật về sinh học phân tử, sinh học tế bào, di truyền học,... trong nghiên cứu sinh học ở nước ta.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đã đưa ra các kết luận như sau:
1. Đã sử dụng vector chuyển gen dựa trên lentivirus để tạo các quần thể tế bào gốc phôi gà mang gen IL–6 người.
2. Đã thiết kế mồi và tổng hợp được đầu dò gắn chất huỳnh quang Alexa Fluor® 568 đặc hiệu với gen IL–6 của người bằng phản ứng PCR.
3. Đã bước đầu thành công trong việc phát hiện gen chuyển IL–6 người trong nhân tế bào gốc phôi gà sau chuyển gen bằng kỹ thuật FISH sử dụng đầu dò tổng hợp được.
KIẾN NGHỊ
Từ những kết quả đã thu được, chúng tôi đưa ra một số kiến nghị như sau:
1. Tiếp tục sử dụng vector chuyển gen dựa trên lentivirus để chuyển gen vào tế bào gốc phơi gà.
2. Điều chỉnh kích thước đầu dị để nâng cao hiệu quả phản ứng lai FISH.
3. Mở rộng ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện gen trong tế bào, lai với nhiễm sắc thể ở giai đoạn kỳ giữa nguyên phân để xác định vị trí gen trên nhiễm sắc thể.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Đặng Văn Đức, Nguyễn Lai Thành, Bùi Việt Anh, Đỗ Doãn Lợi (2010), “Nhận biết và ni cấy đơn dịng tế bào gốc phân lập từ nút phôi của túi phôi chuột”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 26
(2), tr. 71-82.
2. Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Lai Thành, Nguyễn Duy Điều, Thân Thị Trang Uyên, Lê Thị Tuyết, Thân Thị Linh Quyên (2010), “Thử nghiệm chuyển gen EGFP trên gà (Gallus gallus domesticus) sử dụng vector pT2/BH- CVpf-SB11 bằng phương pháp vi tiêm vào phôi gà 0 giờ ấp”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Cơng nghệ, 26 (2S), tr. 124-131.
3. Bùi Võ Minh Hoàng, Nguyễn Duy Tài, Phan Chiến Thắng (2007), “Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chấn đoán trước sinh các dị bội nhiễm sắc thể thường gặp”, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, 11 (Phụ bản số 1), tr. 289-295.
4. Nguyễn Mộng Hùng, Vũ Văn Vụ, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ sinh học -
Tập 2: Công nghệ Tế bào, Nxb Giáo dục, Hà Nội.
5. Nguyễn Văn Kình, Nguyễn Quốc Tuấn, Nguyễn Tuấn Anh (2007), Thực hành
Ứng dụng Gen trị liệu, Nxb Y học, Hà Nội.
6. Nguyễn Tiến Lung, Nguyễn Lai Thành (2012), “Thử nghiệm chuyển gen IL-6 người bằng lentivirus vào tế bào gốc phôi gà”, Tạp chí Khoa học và Cơng nghệ - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 50 (3C), tr. 401-406.
7. Nguyễn Văn Nguyên, Lê Thanh Tùng, Lưu Xuân Hòa, Vũ Tuấn Nam, Vũ Minh Hào, Đinh Thái Bình (2011), “Thử nghiệm kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ F.I.S.H nhận diện nhanh và chuẩn xác một số loài tảo giáp độc hại”, in
Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học và cơng nghệ biển tồn quốc lần thứ V,
8. Đinh Thị Hồng Nhung, Ngô Diễm Ngọc, An Thuỳ Lan, Hoàng Thị Thanh Mộc, Nguyễn Thị Phương Mai, Nguyễn Thị Mai Hương, Lý Thị Thanh Hà, Trần Thị Nga, Nguyễn Thanh Liêm (2008), “Áp dụng kỹ thuật huỳnh quang tại chỗ trong phát hiện bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể tại Bệnh viện Nhi Trung ương”, Tạp chí nghiên cứu y học, 57, tr. 57-62.
9. Nguyễn Thị Tân Sinh, Ngô Diễm Ngọc, An Thuỳ Lan, Đinh Thị Hồng Nhung, Lê Thị Liễu, Nguyễn Thanh Liêm (2011), “Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoán trước sinh các lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp”, Tạp chí Y học lâm sàng, Số đặc biệt tháng 2/2011, tr. 253-258.
10. Lê Thị Tuyết, Nguyễn Lai Thành, Nguyễn Duy Điều, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Phạm Nguyệt Hằng (2010), “Thử nghiệm chuyển gen GFP trên gà (Gallus
gallus domesticus) sử dụng vector pT2/BH-CVpf-SB11 bằng phương pháp
chuyển gen qua tinh trùng”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên
và Công nghệ, 26 (2), tr. 266-273.
Tài liệu tiếng Anh
11. Abd-Elsalam K.A. (2003), “Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design”, African Journal of biotechnology, 2 (5), pp. 91-95.
12. Bishop R. (2010), “Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance”, Bioscience Horizons, 3 (1), pp. 85-95.
13. Bolzer A., Kreth G., Solovei I., Koehler D., Saracoglu K., Fauth C., Müller S., Eils R., Cremer C., Speicher M.R. (2005), “Three-dimensional maps of all chromosomes in human male fibroblast nuclei and prometaphase rosettes”,
PLoS biology, 3 (5), pp. e157.
14. Bottari B., Ercolini D., Gatti M., Neviani E. (2009), “FISH in food microbiology”, in Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)—Application Guide, Springer, pp. 395-408.
15. Brammer S.P., Vasconcelos S., Poersch L.B., Oliveira A.R., Brasileiro-Vidal A.C. (2013), “Genomic in situ Hybridization in Triticeae: A Methodological Approach”, in Plant Breeding from Laboratories to Fields, InTech.
16. Brown W.R., Hubbard S.J., Tickle C., Wilson S.A. (2003), “The chicken as a model for large-scale analysis of vertebrate gene function”, Nature Reviews Genetics, 4 (2), pp. 87-98.
17. Chen B.-Y., Janes H.W., Chen S. (2002), “Computer programs for PCR primer design and analysis”, in Methods in Molecular Biology 192: PCR Cloning Protocols, Springer, pp. 19-29.
18. Cyriac S., Churchil R.R., George T.G. (2012), “Transgenic chicken: methods and applications”, Journal of Indian Veterinary Association, Kerala (JIVA), 10 (2), pp. 67-71.
19. Darouich S., Popovici C., Missirian C., Moncla A. (2012), “Use of DOP-PCR for amplification and labeling of BAC DNA for FISH”, Biotechnic & Histochemistry, 87 (2), pp. 117-121.
20. Das R.M., Van Hateren N.J., Howell G.R., Farrell E.R., Bangs F.K., Porteous V.C., Manning E.M., Mcgrew M.J., Ohyama K., Sacco M.A. (2006), “A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon”, Developmental biology, 294 (2), pp. 554-563.
21. Davenport-Jones J. (2000), “Nick Translation and Random Hexamer Labeling of DNA”, in The Nucleic Acid Protocols Handbook, Humana Press, pp. 123-
125.
22. De Muro M.A. (2008), “Probe Design: Production and Applications”, in
Molecular Biomethods Handbook, Springer, pp. 41-53.
23. Doak S.H., Saidely D., Jenkins G.J.S., Parry E.M., Griffiths A.P., Baxter J.N., Parry J.M. (2004), “Generation of locus-specific probes for interphase fluorescence in situ hybridisation--application in Barrett's esophagus”,
24. Etches R.J., Clark M.E., Toner A., Liu G., Gibbins A.M. (1996), “Contributions to somatic and germline lineages of chicken blastodermal cells maintained in culture”, Molecular Reproduction and Development, 45, pp.
291-298.
25. Gilbert S.F. (2006), Development biology, 6th edition, Swarthmore College,
Sinauer Associates, Inc. Publishers Sunderland, Massachusettes.
26. Gozzetti A., Le Beau M.M. (2000), “Fluorescence in situ hybridization: uses
and limitations”, Seminars in hematology, 37 (4), pp. 320-333.
27. Hamburger V., Hamilton H.L. (1951), “A series of normal stages in the development of the chick embryo”, Journal of Morphology, 88 (1), pp. 49–92. 28. Harel-Markowitz E., Gurevich M., Shore L.S., Katz A., Stram Y., Shemesh M.
(2009), “Use of sperm plasmid DNA lipofection combined with REMI (restriction enzyme-mediated insertion) for production of transgenic chickens expressing eGFP (enhanced green fluorescent protein) or human follicle- stimulating hormone”, Biology of Reproduction, 80 (5), pp. 1046-1052.
29. Harwood W.A., Bilham L.J., Travella S., Salvo-Garrido H., Snape J.W. (2004), “Fluorescence in situ hybridization to localize transgenes in plant chromosomes”, in Transgenic Plants: Methods and Protocols, Springer, pp.
327-339.
30. Hawkins A.L., Jones R.J., Zehnbauer B.A., Zicha M.S., Collector M.J., Sharkis S.J., Griffin C.A. (1992), “Fluorescence in situ hybridization to determine engraftment status after murine bone marrow transplant”, Cancer genetics and cytogenetics, 64 (2), pp. 145-148.
31. Hopman A.H.N., Ramaekers F.C.S., Speel E.J.M. (1998), “Rapid synthesis of biotin-, digoxigenin-, trinitrophenyl-, and fluorochrome-labeled tyramides and their application for In situ hybridization using CARD amplification”, Journal
32. Horiuchi H., Furusawa S., Matsuda H. (2006), “Maintenance of chicken embryonic stem cells in vitro”, in Embryonic stem cell protocols – Volume 1:
Isolation and characterization, Humana Press, New York, USA, pp. 17-34.
33. Houdebine L.-M. (2009), “Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals”, Comparative immunology, microbiology and infectious diseases, 32 (2), pp. 107-121.
34. Ishibashi T., Takoh K., Kaji H., Abe T., Nishizawa M. (2007), “A porous membrane–based culture substrate for localized in situ electroporation of