Trong nghiên cứu này, hai thông số được tối ưu hóa là nhiệt độ bắt cặp mồi và nồng độ ion Mg2+. Nhiệt độ bắt cặp mồi (Annealing template – Ta) là nhiệt độ cho phép mồi bắt cặp bổ sung với mạch khuôn, thường lớn hơn nhiệt độ biến tính mồi (Tm) khoảng 5 – 10oC. Cặp mồi được thiết kế có Tm = 44,6–46,2oC nên chúng tơi tiến hành thử nghiệm với các giá trị Ta trong khoảng 45oC – 55oC. Thông số được tối ưu hóa thứ hai là nồng độ Mg2+, có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Taq
DNA polymerase, từ đó ảnh hưởng đến độ đặc hiệu của phản ứng. Nồng độ Mg2+ cao làm tăng độ đặc hiệu nhưng lại làm giảm hiệu suất phản ứng, trong khi giá trị này thấp làm tăng sản phẩm không đặc hiệu. Chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên khoảng nồng độ Mg2+ từ 1,00 – 4,00 mM (các phản ứng PCR thường sử dụng trong khoảng này).
Đánh giá hiệu suất phản ứng PCR
Các mẫu sản phẩm PCR được định lượng ADN khuếch đại bằng máy đo Biophotometer Plus (Eppendorf). Kết quả phân tích thể hiện trên Hình 15 (xem
thêm Phụ lục 1). Khi nồng độ Mg2+ tăng dần (1,00–3,25 mM), lượng sản phẩm được khuếch đại càng nhiều, nhưng khi nồng độ Mg2+ lên quá cao (4,00 mM) thì phản ứng PCR bị ức chế, lượng sản phẩm thu được ít hơn. Nhiệt độ gắn mồi Ta = 49,3oC cho kết quả khuếch đại ADN tốt nhất trong các nhiệt độ được thử nghiệm. Trong tất cả các mẫu sản phẩm PCR, mẫu được tổng hợp với nồng độ Mg2+ 3,25 mM và Ta = 49,3oC có hàm lượng ADN cao nhất (1.445 ± 253 ng/μl).
Hình 15. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi và nồng độ ion Mg2+ tới hiệu suất phản ứng PCR
Thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn. Mẫu được tổng hợp ở điều kiện Ta = 49,3oC, Mg2+
3,25 mM có hàm lượng ADN lớn nhất (1.445 ± 253 ng/μl).
Đánh giá độ chính xác trình tự của sản phẩm PCR
Ngồi việc thu được lượng sản phẩm lớn, yêu cầu quan trọng trong việc tổng hợp đầu dò là đoạn được khuếch đại phải đảm bảo có trình tự chính xác. Vì vậy chúng tôi thu một số mẫu sản phẩm PCR có hàm lượng ADN được khuếch đại khác nhau để tiến hành giải trình tự nucleotide: nồng độ Mg2+ 1,75 mM và 3,25 mM, mỗi nồng độ đó chọn hai mẫu với Ta có giá trị 45,9oC và 49,3oC. Kết quả được phân tích bằng chương trình BioEdit và so sánh với trình tự gốc sử dụng chương trình Ape plasmid editor – APE.
Kết quả giải trình tự nucleotide cho thấy các sản phẩm PCR đều có trình tự tương đồng cao với trình tự đầu dị theo lý thuyết. Mặc dù vậy, các mẫu đó cho mức độ tín hiệu khác nhau khá rõ rệt: sản phẩm tổng hợp ở nồng độ Mg2+ 3,25 mM, Ta = 49,3oC cho tín hiệu rõ nét nhất, độ nhiễu thấp; các mẫu cịn lại có độ nhiễu cao hơn hoặc tín hiệu khơng rõ bằng, trong đó sản phẩm tổng hợp ở nồng độ Mg2+ 3,25 mM, Ta = 49,3oC (Hình 16, xem thêm Phụ lục 2).
Hình 16. Kết quả giải trình tự nucleotide các sản phẩm PCR và so sánh với trình tự đầu dị theo lý thuyết
(A) Kết quả giải trình tự nucleotide các mẫu sản phẩm PCR ở một số điều kiện tổng hợp khác nhau; (B) Kết quả so sánh các trình tự đó với trình tự đầu dò theo lý thuyết.
Từ những phân tích trên, kết hợp kết quả tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR, chúng tôi xác định nhiệt độ gắn mồi 49,3oC và nồng độ Mg2+ 3,25 mM là điều kiện tốt nhất cho phản ứng khuếch đại với cặp mồi đã thiết kế. Sản phẩm PCR thu được có hàm lượng ADN cao, trình tự nucleotide chính xác so với trình tự khn mẫu, đáp ứng được yêu cầu làm đầu dò cho phản ứng lai FISH.