Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp và kỹ thuật sử dụng
2.4.3. Kỹ thuật xác định biểu hiện gen bằng phương pháp QuantiGene Plex
Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng kỹ thuật xét nghiệm biểu hiện gen của QuantiGene Plex (QuantiGene 2.0 assay). Đây là kỹ thuật dựa trên khả năng tương tác đặc hiệu, lai RNA bằng cách sử dụng các hạt Luminex xMAP và được thực hiện trên các đĩa 96 giếng. Biểu hiện của 76 gen tham gia và con đường tín hiệu JAK/STAT và 4 gen đối chứng được định lượng trực tiếp trên các RNA đích cần xác định qua cơng nghệ khuếch đại tín hiệu branch DNA (bDNA). Kỹ thuật này giống ELISA với đối tượng lai trực tiếp là phân tử mRNA với phân tử Label Extenders đặc hiệu và không cần phiên mã ngược. Hơn nữa kỹ thuật này cho phép xác định mức độ biểu hiện gen thông qua mRNA lên đến 80 gen quan tâm và các gen quản gia trong cùng một giếng mà khơng có phản ứng chéo, làm giảm số lượng mẫu cần thiết.
Bước 1 Bước 2 Bước 3 Bước 4
Bước 1: Mẫu mô ung thư gan và mẫu mô gan từ các bệnh nhân ung thư trải
qua phẫu thuật được nghiền nhỏ trong môi trường lạnh để đảm bảo RNA khơng bị phân hủy. Sau đó được tách RNA tổng số.
Bước 2: Mẫu RNA tổng số được ủ qua đêm với các tín hiệu đặc hiệu cho
từng đối tượng RNA đích xác định.
Bước 3: Khuếch đại tín hiệu đạt được bằng cách sử dụng cơng nghệ branch
DNA (bDNA). Một phân tử Pre-Ampli lai với từng cặp Label Extenders, (không phải với các đầu dị riêng lẻ). Sau đó, nhiều phân tử Ampli lai với mỗi bộ lọc PreAmp. Cuối cùng, kết quả cho với mỗi bộ khuếch đại Amp có nhiều oligonucleotide thăm dị nhãn lai.
Bước 4: Bổ sung streptavidin phycoerythrin (SAPE) để tạo ra tín hiệu tỷ lệ
thuận với lượng RNA đích có trong mẫu. Tín hiệu được đọc bằng Luminex.
Các bước thực hiện cụ thể trong ngày 1:
Bước 1: Pha loãng RNA tổng số về nồng độ 10 ng/μL với thể tích 25 μL/giếng. Bước 2: Chuẩn bị thể tích hỗn hợp hạt từ (Working Bead Mix) theo tỷ lệ ở
Bảng 2.2. Giữ hỗn hợp ở nhiệt độ phịng, tránh ánh sáng, khơng để trên đá. Bảng 2.9: Thành phần hỗn hợp hạt từ stt Hóa chất 96 giếng (μL) 1 Nước Nuclease-free 2352 2 Dung dịch Lysis 4476 3 Hóa chất Block 269 4 Proteinase K 27 5 Hạt từ (Capture Beads)-Vortex 30s trước khi thêm vào
134
6 Bộ Probe 806
Tổng số 8064
Bước 3: Vortex hỗn hợp hạt từ đã chuẩn bị trong 10s để trộn, sau đó sử dụng
pipet chia vào các giếng của đĩa lai (Hybridization Plate), mỗi giếng 60 μL sử dụng pipet đa kênh.
Bước 4: Thêm RNA tổng số của các mẫu đã pha lỗng với thể tích là 25
μL/giếng. Mỗi mẫu thay đầu côn 1 lần. Tại giếng chứng: Thêm 40 μL dung dịch đồng nhất vào 3 giếng chứng. Lặp lại 8 mẫu đầu tiên.
Bước 5: Đậy kín đĩa lai sử dụng miếng dán. Tháo mặt sau của miếng dán, đặt
vào chính giữa trung tâm của đĩa lai, sử dụng con lăn mềm lăn qua để đảm bảo đĩa lai đã được đậy kín hồn tồn ngăn chặn sự bay hơi.
Bước 6: Đặt một đĩa đảo ngược (không được cung cấp) vào máy ủ tại nhiệt
độ 56oC. Sau đó đặt đĩa lai vào và ủ trong 18-22h ở 54oC ± 1oC với tốc độ 600 vòng/phút.
Bước 7: Sau khi ủ, tiến hành đến ngày 2.
Các bước thực hiện cụ thể trong ngày 2:
Bước 1: Bật và hiệu chỉnh máy Luminex theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Phải mất 30 phút cho các tia laser để khởi động. Thiết lập chương trình chạy máy Luminex trước khi hồn thành thí nghiệm.
Bước 2: Làm ấm dung dịch Pre-Amplifier, Amplifier, và dung dịch chứa
Label Probe trước khi sử dụng tại nhiệt độ 37oC trong 30 phút để hòa tan kết tủa và trộn đều bằng cách đảo nhẹ ống trước khi dùng. Đưa về nhiệt độ phịng khi sử dụng, đưa chất pha lỗng SAPE về nhiệt độ phòng.
Bước 3: Thêm 0,6 mL đệm rửa 1 (wash buffer component 1) và 10 mL đệm
rửa 2 (wash buffer component 2) vào 189 mL nước nuclease free water. Thể tích này đủ cho 1 đĩa. Chuẩn bị dịch theo số lượng đĩa định dùng.
Bước 4: Đưa đĩa lai từ máy ủ VorTemp và điều chỉnh nhiệt độ về 50°C ±
1°C. Sử dụng nhiệt độ đã cài trước đó, restart lại máy để đảm bảo nhiệt độ là 50°C ± 1°C.
Bước 5: Ly tâm đĩa lai tại 240 xg trong một phút ở nhiệt độ phòng. Tháo
miếng đậy và pipet lên xuống 5 lần, sau đó chuyển hồn tồn từ đĩa lai sang đĩa từ. Sử dụng pipet đa kênh, mỗi một cột thay đầu côn sau mỗi lần chuyển.
Bước 6: Rửa đĩa
- Đặt đĩa từ vào máy rửa đĩa từ cầm tay (Hand-Held Magnetic Plate Washer) sao cho vị trí A1 của đĩa 96 giếng khớp với vị trí A1 trên máy rửa.
- Khóa đĩa 96 giếng trên đĩa bằng cách đẩy hai thanh bảo vệ nằm ở mỗi đầu của máy rửa hướng tới đĩa từ cho đến khi chúng chồng lên skirt của đĩa. Kiểm tra đĩa từ được khóa an tồn bằng cách giữ trong lịng bàn tay và nhẹ nhàng nhấc đĩa 96 giếng lên.
- Loại bỏ dung dịch có trong giếng bằng cách nhanh chóng đảo ngược chúng qua bồn rửa hay thùng rác sau đó nhẹ nhàng thấm qua 1 lớp khăn giấy để loại bỏ bất cứ dung dịch nào cịn sót lại.
- Khơng di chuyển đĩa từ khỏi máy rửa đĩa từ cầm tay. - Thêm 100 μL dung dịch đệm rửa 1X vào mỗi giếng. - Đợi 15 giây để hạt từ tích lũy lắng xuống dưới đáy giếng.
- Loại bỏ đệm rửa trong mỗi giếng bằng cách đảo ngược nhanh đĩa qua bồn rửa hay thùng rác. Lặp lại hành động rửa hai lần cho tổng số lần rửa đĩa là 3. Sau lần rửa cuối cùng, đặt đĩa từ 96 giếng lên một vài tờ giấy thẩm để loại bỏ dịch dư.
Bước 7: Tiền khuếch đại lai (Pre-Amplifier Hybridization)
Chuyển dung dịch tiền khuếch đại lai Pre-Amplifier Hybridization sang bình chứa thuốc thử thể tích 25 mL và pipet 100 μL dung dịch vào từng giếng bằng pipet đa kênh.
- Bịt kín đĩa từ bằng một tấm dán. Tháo đĩa từ từ máy rửa đĩa cầm tay. Lắc với tốc độ 800 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng để đảm bảo hạt được nối lại.
Đặt tấm tách từ tính vào máy ủ VorTemp và ủ trong 1 giờ tại 50°C ± 1°C, 600 vòng/phút.
Bước 8: Sau 1 giờ ủ, lấy đĩa ra khỏi VorTemp, gỡ miếng dán, chèn đĩa từ vào
máy rửa đĩa cầm tay, lặp lại quy trình rửa từ bước 6.
Bước 9: Khuếch đại lai (Amplifier Hybridization)
- Chuyển dung dịch Amplifier vào 25 mL thuốc thử sau đó pipet 100 μL vào mỗi giếng bằng pipet đa kênh.
- Đậy đĩa từ với miếng dán. Tháo đĩa từ từ máy rửa đĩa cầm tay. Lắc với tốc độ 800 vòng/phút tại nhiệt độ phòng.
- Đặt đĩa từ vào máy VorTemp ủ lắc trong vòng 1 giờ tại 50°C ± 1°C tại 600 vòng/phút.
Bước 10: Rửa đĩa. Sau 1 giờ ủ, lấy đĩa ra khỏi VorTemp, gỡ miếng dán, chèn
đĩa từ vào máy rửa đĩa cầm tay, lặp lại quy trình rửa từ bước 6.
Bước 11: Lai Label Probe
Chuyển dung dịch Label Probe vào 25 mL thuốc thử sau đó pipette 100 μL vào mỗi giếng bằng pipet đa kênh.
Đậy đĩa từ với miếng dán. Tháo đĩa từ từ máy rửa đĩa cầm tay. Lắc với tốc độ 800 vòng/phút tại nhiệt độ phòng.
Đặt Magnetic Separation Plate vào máy VorTemp ủ lắc trong vòng, 1 giờ tại 50°C ± 1°C tại 600 vòng/phút.
Bước 12: Chuẩn bị SAPE
- Vortex và ly tâm ngắn SAPE để trộn đều, sau đó ly tâm ngắn để thu thập các nội dung ở dưới cùng của ống.
- Trong ống 15 mL, thêm 36 μL SAPE vào 12 mL Dung dịch thuốc thử để pha loãng SAPE.
- Vortex trong 15 giây để trộn và tránh ánh sáng.
Bước 13: Rửa đĩa. Sau khi ủ 1 giờ, lặp lại quá trình rửa từ bước 6. Bước 14: Gắn SAPE
Chuyển SAPE Working Reagent vào 25 mL-dung dịch thuốc thử và pipette 100 μL vào mỗi giếng. Sử dụng pipet đa kênh.
Đậy kín đĩa từ bằng tấm dán; tháo đĩa từ từ máy rửa đĩa cầm tay; đặt trên máy lắc tại nhiệt độ phòng và lắc với tốc độ 800 vịng/phút sau đó lắc tiếp 30 phút ở 600 vịng/phút.
Bước 15: Rửa đĩa, lặp lại q trình rửa từ bước 6 nhưng sử dụng SAPE
Wash Buffer.
Bước 16:
- Thêm 130 μL of SAPE Wash Buffer vào mỗi giếng.
- Đậy kín đĩa từ bằng tấm dán sau đó tháo đĩa từ từ máy rửa đĩa cầm tay và bọc giấy nhôm.
- Đặt đĩa lên máy lắc Microtiter và lắc ở tốc độ 800 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng.
- Đọc tấm ngay trên máy Luminex.
Các gen nghiên cứu được đánh giá sẽ được chia làm 4 nhóm và nhóm gen đối chứng.
a. Nhóm gen tín hiệu
Bảng 2.10: Các gen tín hiệu
Tên viết tắt Tên gen Vị trí trên NST
CLCF1 Cardiotrophin-like cytokine factor 1 11q13.3
CNTF Ciliary neurotrophic factor 11q12.2
CNTFR Ciliary neurotrophic factor receptor 9p13
EGFR Epidermal growth factor receptor 7p12
EPOR Erythropoietin receptor 19p13.3-p13.2
FAS Fas (TNF receptor superfamily, member 6) 10q24.1
GHR Growth hormone receptor 5p13-p12
IFNAR1 Interferon (alpha, beta,omega) receptor 1 21q22.1|21q22.11
IFNG Interferon, gamma 12q14
IFNGR1 Interferon gamma receptor 1 6q23.3
IL10 Interleukin 10 1q31-q32
IL10RA Interleukin 10 receptor, alpha 11q23
IL10RB Interleukin 10 receptor, beta 21q22.1-q22.2| 21q22.11
IL20 Interleukin 20 1q32
IL2RA Interleukin 2 receptor, alpha 10p15-p14
IL2RG Interleukin 2 receptor, gamma Xq13.1
IL4 Interleukin 4 5q31.1
IL4R Interleukin 4 receptor 16p12.1-p11.2
IL6ST Interleukin 6 signal transducer (gp130,
oncostatin M receptor) 5q11
INSR Insulin receptor 19p13.3-p13.2
IRF1 Interferon regulatory factor 1 5q31.1
LEP Leptin 7q31.3
LEPR Leptin receptor 1p31
OSM Oncostatin M 22q12.2
PRLR Prolactin receptor 5p13.2
TSLP Thymic stromal lymphopoietin 5q22.1
b. Nhóm gen JAK/STAT
Bảng 2.11: Các gen JAK/STAT
Tên viết tắt Tên gen Vị trí trên NST
JAK1 Janus kinase 1 1p32.3-p31.3
JAK2 Janus kinase 2 9p24
JAK3 Janus kinase 3 19p13.1
STAT1 Signal transducer and activator of
transcription 1, 91kda 2q32.2
STAT2 Signal transducer and activator of
transcription 2, 113kda 12q13.3
STAT3 Signal transducer and activator of
transcription 3 (acute-phase response factor) 17q21.31
STAT4 Signal transducer and activator of
transcription 4 2q32.2-q32.3
transcription 5A
STAT5B Signal transducer and activator of
transcription 5B 17q11.2
STAT6 Signal transducer and activator of
transcription 6, interleukin-4 induced 12q13
TYK2 Tyrosine kinase 2 19p13.2
c. Nhóm gen đích
Bảng 2.12: Các gen đích
Tên viết tắt Tên gen Vị trí trên NST
A2M Alpha-2-macroglobulin 12p13.31
BCL2L1 BCL2-like 1 20q11.21
CCND1 Cyclin D1 11q13
CDKN1A Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A 6p21.2
CEBPB CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP),
beta 20q13.1
CREBBP CREB binding protein 16p13.3
CRK V-crk sarcoma virus CT10 oncogene
homolog (avian) 17p13.3
CRP C-reactive protein, pentraxin-related 1q21-q23
GBP1 Guanylate binding protein 1, interferon-
inducible, 67kda 1p22.2
ISG15 ISG15 ubiquitin-like modifier 1p36.33
JUN Jun proto-oncogene 1p32-p31
MPL Myeloproliferative leukemia virus oncogene 1p34
MYC V-myc myelocytomatosis viral oncogene
homolog (avian) 8q24.21
NFKB1 Nuclear factor of kappa light polypeptide
gene enhancer in B-cells 1 4q24
d. Nhóm gen điều hòa
Bảng 2.13: Các gen điều hòa
Tên viết tắt Tên gen Vị trí trên
NST
CISH Cytokine inducible SH2-containing protein 3p21.3
PIAS1 Protein inhibitor of activated STAT, 1 15q
PIAS2 Protein inhibitor of activated STAT, 2 18q21.1
PTPN1 Protein tyrosine phosphatase, non-receptor 1 20q13.1-q13.2
PTPN6 Protein tyrosine phosphatase, non-receptor 6 12p13
PTPRC Protein tyrosine phosphatase, receptor type C 1q31-q32
SH2B1 SH2B adaptor protein 1 16p11.2
SIT1 Signaling threshold regulating transmembrane
adaptor 1 9p13-p12
SLA2 Src-like-adaptor 2 20q11.23
SMAD1 SMAD family member 1 4q31
SMAD2 SMAD family member 2 18q21.1
SMAD3 SMAD family member 3 15q22.33
SOCS1 Suppressor of cytokine signaling 1 16p13.13
SOCS2 Suppressor of cytokine signaling 2 12q
SOCS3 Suppressor of cytokine signaling 3 17q25.3
SOCS4 Suppressor of cytokine signaling 4 14q22.1
SOCS5 Suppressor of cytokine signaling 5 2p21
SP1 Sp1 transcription factor 12q13.1
STAM Signal transducing adaptor molecule (SH3
domain and ITAM motif) 1 10p14-p13
STAM2 Signal transducing adaptor molecule (SH3
domain and ITAM motif) 2 2q23.3
STUB1 STIP1 homology and U-box containing
protein 1, E3 ubiquitin protein ligase 16p13.3
THPO Thrombopoietin 3q27
e. Nhóm gen đối chứng
Nghiên cứu được thực hiện với 4 gen quản gia là: GUSB, HPRT1, TBP, TFRC.