3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu3.1.1. Đặc điểm tuổi và giới 3.1.1. Đặc điểm tuổi và giới
Bảng 3.14: Đặc điểm tuổi và giới của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu
Đặc điểm Số bệnh nhân Tỷ lệ (%) Tuổi (năm) <50 7 19 >50 30 81 Giới tính Nam 31 84 Nữ 6 16
Phân bố tuổi và giới tính của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu được thể hiện trong Bảng 3.1. Trong đó, phần lớn trong nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu có độ tuổi trên 50 tuổi (chiếm 81%) và chủ yếu là nam giới (84%).
3.1.2. Đặc điểm cận lâm sàng
* Đặc điểm huyết đồ
Bảng 3.15: Đặc điểm huyết học của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu
Số liệu trong Bảng 3.2 cho thấy, chỉ số huyết đồ của các bệnh nhân tham gia nghiên cứu ở mức độ bình thường, khơng có bệnh nhân cao hay thấp điển hình. Tuy nhiên, chỉ số huyết sắc tố và tiểu cầu biến thiên mạnh ở các bệnh nhân.
* Đặc điểm hóa sinh
Chỉ số Median 25% - 75% n
Hồng cầu (M/uL) 4,68 4,17 - 5,1 37
Huyết sắc tố (g/dL) 145 134 - 153 37
Bạch cầu (K/uL) 6,86 5,4 - 8,3 37
Bảng 3.16: Đặc điểm cận lâm sàng Chỉ số Median 25%-75% n PT(s) 12,5 11,4 – 14,1 35 PT(%) 94 8,3 – 95,5 35 INR 1,03 1,0 – 1,1 35 Fibrinogen(g/L) 3,7 2,9 – 4,1 34 APTT(s) 31,4 29,8 – 33,8 35
AST (SGOT) (U/L) 36,5 25 – 42,9 37
ALT (SGPT) (U/L) 35,4 29 – 49,7 37 BilirubinTP (µmol/L) 10,95 8,5 – 14,5 36 BilirubinTT ((µmol/L) 4,5 3,4 – 5,9 36 Abumin (g/L) 40,8 38,2 – 43,5 36 AFP (ng/mL) 20 7,5 – 186,4 36 CEA (ng/mL) 2,8 1,7 - 4 28
Số liệu trong Bảng 3.3 cho thấy, chỉ số hóa sinh trung bình của những bệnh nhân tham gia nghiên cứu ở mức độ bình thường. Nồng độ AFP > 300 ng/mL, là chỉ số của dấu hiệu ung thư gan nguyên phát ở những bệnh nhân ung thư gan, thấy rõ sự biến thiên chỉ số ở các bệnh nhân ung thư gan. Bên cạnh đó, các chỉ số ung thư CEA ở mức bình thường được đánh giá xem xét như chưa có sự xâm lấn di căn tới các cơ quan nội tạng khác.
3.2. Mức độ biểu hiện các gen nghiên cứu
Mức độ biểu hiện của các gen trong con đường tín hiệu JAK/STAT ở mơ LCU và mô U của các bệnh nhân HCC đã được định lượng tương đối bằng kỹ thuật QuantiGene Plex. Kết quả cho thấy có sự khác biệt trong mức độ biểu hiện của một số gen trong con đường tín hiệu JAK/STAT.
3.2.1. Mức độ biểu hiện, tương quan biểu hiện giữa mơ LCU và mơ U của nhóm gen tín hiệu
* Mức độ biểu hiện nhóm gen tín hiệu trong mơ U và LCU
Nhóm gen có vai trị nhận tín hiệu gồm các phối tử và thụ thể của chúng có sự khác nhau trong biểu hiện mRNA giữa mơ U và mơ LCU. Nhóm gen tín hiệu gồm 28 gen: CLCF1, CNTF, CNTFR, CSF1R, CSF2, EGFR, EPOR, FAS, GHR,
IFNAR1, IFNG, IFNGR1, IL10, IL10RA, IL10RB, IL20, IL2RA, IL2RG, IL4, IL4R, IL6ST, INSR, IRF1, LEP, LEPR, OSM, PRLR, TSLP. Tuy nhiên, trong nghiên cứu
này sự khác biệt biểu hiện gen tín hiệu giữa mơ LCU và mơ U ở bệnh nhân HCC chỉ tìm thấy ở 17 gen, bao gồm: IL10, IL10RA, LEP, LEPR, GHR, INSR, IFNAR1,
IL6ST, CSF1R, EGFR, FAS, TSLP, CNTFR, EPOR, IL4R, IL4, và PRLR. Kết quả
được thể hiện trên Hình 3.1, 3.2, 3.3 và 3.4.
Hình 3.13: Biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện mRNA các gen CNTFR, EPOR, IL4R và IL4 ở mơ LCU và mơ U
Hình 3.1 cho thấy mức độ biểu hiện mRNA của các gen CNTFR, EPOR,
IL4R, và IL4 có sự khác biệt đáng kể giữa mơ LCU và mơ U. Trong đó, biểu hiện
gen EPOR và IL4R ở mô LCU (0,34 và 0,89) cao hơn so với ở mô U (0,29 và 0,74) với giá trị p lần lượt là 0,001 và 0,01. Ngược lại, gen CNTFR và IL4 lại có biểu hiện mRNA ở mơ LCU (2,97 và 0,14) thấp hơn biểu hiện mRNA của chúng ở mô U (4,00 và 0,16) với p = 0,009 và 0,03.
CNTFR (Ciliary neurotrophic factor receptor) là gen mã hóa thụ thể
CNTFR là thụ thể cho cytokine loại 1 được chứng minh là có liên quan đến con đường tín hiệu JAK/STAT có vai trị trong sự tăng sinh, biệt hóa, di cư tế bào và apoptosis. Đặc biệt, CNTFR đặc trưng cho giai đoạn IV của HCC. Sự methyl hóa của gen CNTFR dẫn tới rối loạn con đường JAK/STAT đưa tới sự biểu hiện bất thường của các yếu tố phiên mã (NFKB1 trong con đường MAPK và STAT3 trong con đường JAK/STAT) và các gen đích tương ứng (như GADD45B, FOSB, và
BIRC5) dẫn tới sự rối loạn chức năng tiếp theo trong sự phát triển tế bào,
khác biệt trong biểu hiện mRNA của gen CNTFR giữa mơ LCU và mơ U có ý nghĩa thống kê với mức biểu hiện mRNA cao hơn trong mơ LCU (Hình 3.1).
EPOR là gen mã hóa cho thụ thể của Erythropoietin là một tín hiệu kích
thích hormone glycoprotein của hồng cầu được sản xuất trong gan và là một thành viên của siêu họ thụ thể cytokine, biểu hiện chủ yếu trên các đơn vị hình thành erythroid. Epo thực hiện vai trị thơng qua liên kết cụ thể với thụ thể EPOR. Epo có thể kích hoạt chức năng gen thơng qua một chuỗi tín hiệu, Epo kích hoạt tyrosine kinase JAK2, phosphoryl hóa và chuyển vị trí trong nhân của STAT5, do đó thúc đẩy sự sống sót của tế bào tiền thân, tăng sinh và biệt hóa thơng qua thụ thể EPOR. EPOR đã được chứng minh có vai trị trong nhiều loại ung thư, như ung thư vú, ung thư thận, ung thư dạ dày, HCC và ung thư thần kinh trung ương . Nghiên cứu biểu hiện của mRNA và protein EpoR được thực hiện bằng phương pháp RT-PCR và phân tích Western blot trên 134 bệnh nhân đã trải qua phẫu thuật cắt bỏ gan điều trị HCC tiên phát liên quan đến HBV cho thấy biểu hiện EpoR mRNA và protein trong gan xơ và gan khơng có khối u có mối tương quan thuận với sự biệt hóa của tế bào khối u, là yếu tố dự báo thuận lợi cho sự sống sót của bệnh . Nghiên cứu của chúng tôi nhận thấy biểu hiện mRNA của gen EPOR cao hơn ở mô LCU so với mơ U (hình 3.1).
Interleukin-4 (IL-4) được biết đến như một chất trung gian và là tín hiệu quan trọng của các phản ứng miễn dịch và viêm. HCC là một loại ung thư liên quan đến viêm điển hình và các biến thể di truyền trong gen IL-4 có thể liên quan
đến nguy cơ HCC liên quan đến HBV thông qua con đường JAK/STAT. IL-4 ức chế sự biểu hiện và sự nhân lên của HBV trong dòng tế bào ung thư Hep3B . Những biến thể di truyền của gen IL4 được chứng minh là yếu tố nguy cơ của HCC liên quan tới HBV . Nghiên cứu biểu hiện của gen IL4R trong 40 cặp mô u
và LCU ở bệnh nhân HCC về mức độ biểu hiện và khả năng xâm lấn của tế bào cho thấy IL-4R đóng vai trị quan trọng trong việc điều chỉnh sự sống và di căn của tế bào HCC và điều chỉnh hoạt động của các đường dẫn tín hiệu JAK1/STAT6, IL-4/IL-4R có thể là mục tiêu điều trị mới cho HCC . Nghiên cứu của chúng tôi nhận thấy mức độ biểu hiện của IL4 tăng lên trong mô U so với mô LCU nhưng mức độ biểu hiện của IL4R lại ngược lại, tăng lên trong mơ LCU so với mơ U
Hình 3.14: Biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện mRNA các gen CSF1R, EGFR,
FAS, TSLP ở mơ LCU và mơ U
Hình 3.2 cho thấy biểu hiện mRNA của gen CSF1R, EGFR, FAS, và TSLP trong mô LCU đều cao hơn mô U với p < 0,001. Cụ thể: gen CSF1 ở mô LCU (0,65) cao hơn trong mô U (0,26). Biểu hiện mRNA gen EGFR trong mô LCU
(3,09) cao hơn trong mô U (1,97). Biểu hiện mRNA gen FAS trong mô LCU (1,02)
cao hơn mô U (0,62). Biểu hiện mRNA gen TSLP trong mô LCU (0,35) cao hơn mô U (0,12).
Biểu hiện của thụ thể yếu tố kích thích đại thực bào 1 (colony-stimulating factor 1 receptor - CSF-1R) trong HCC đã được nghiên cứuvà đánh giá các giá trị tiên lượng của biểu hiện mRNA CSF-1R bằng realtime PCR trên 52 bệnh nhân và đưa ra kết quả biểu hiện mRNA CSF-1R cao hơn đáng kể ở mô gan lân cận so với mô u tương ứng . Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy sự biểu hiện mRNA của gen CSF-1R cao hơn trong mô LCU so với mô U tương ứng (Hình 3.2).
EGFR là gen mã hóa thụ thể tăng trưởng biểu mơ có vai trị quan trọng
trong sự phát triển và tăng sinh của mô u. EGFR được biểu hiện quá mức ở nhiều
loại ung thư, đóng vai trị quan trọng trong ngun nhân hình thành khối u và được xác định là một trong những mục tiêu đầy hứa hẹn trong điều trị ung thư. Một nghiên cứu đã làm rõ vai trò của biểu hiện EGFR đối với bệnh lý lâm sàng của HCC khi nghiên cứu biểu hiện của EGFR tại các cặp mô được lấy từ 60 bệnh nhân HCC. Kết quả cho thấy EGFR biểu hiện cao trong mô u so với mô lân cận và
tương quan đáng kể với giai đoạn lâm sàng, huyết khối u tĩnh mạch cửa, di căn ngoài cơ thể, số lượng u, sự tái phát của khối u, mức độ biệt hóa của khối u và xơ gan ở mơ lân cận u và chỉ số AFP huyết tương . Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sự khác biệt trong biểu hiện mRNA của gen EGFR trong đó biểu hiện mRNA
EGFR cao hơn trong mô LCU so với mơ U (Hình 3.2).
FAS là gen mã hóa cho protein thuộc thành viên của siêu họ thụ thể TNF
đóng vai trị quan trọng trong quá trình apoptosis của tế bào, là một trong những thụ thể truyền tín hiệu của con đường JAK/STAT. Nghiên cứu về biểu hiện mRNA của gen FAS ở những bệnh nhân HCC cho thấy biểu hiện của gen được tăng cường ở những vùng có tế bào viêm xâm nhập tại vùng không ung thư của mơ gan và trên rìa mơ ung thư hay mơ LCU so với mô U . Nghiên cứu của chúng tôi đưa ra kết quả tương đồng, biểu hiện của gen FAS với sự tăng lên có ý nghĩa thống kê của mơ LCU so với mơ U (Hình 3.2).
Thymic stromal lymphopoietin (TSLP) là một cytokine loại I cùng với IL-7 đóng vai trị quan trọng trong sự phát triển tế bào T ở người. Nó đã được báo cáo rằng TSLP kích hoạt JAK1 và JAK2 để gây ra sự phosphoryl hóa STAT5, trong khi IL-7 đạt được sự phosphoryl hóa STAT5 bằng cách kích hoạt JAK1 và JAK3 . Vai trò của TSLP trong apoptosis các tế bào ung thư ruột đã được chứng minh, nhận thấy mức biểu hiện mRNA TSLP giảm đáng kể trong các mô khối U so với các mô LCU của bệnh nhân ung thư ruột kết và mức TSLP tương quan nghịch với điểm số lâm sàng của ung thư ruột . Nghiên cứu của chúng tôi về mức độ biểu hiện mRNA gen TSLP cho thấy sự giảm đáng kể của mức biểu hiện mRNA trong mô U so với mơ LCU ở bệnh nhân HCC (Hình 3.2).
Hình 3.15: Biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện mRNA các gen GHR, INSR,
IFNAR1, IL6ST ở mơ LCU và mơ U
Kết quả trên Hình 3.3 cho thấy biểu hiện mRNA của các gen GHR, INSR, IFNAR1, IL6ST ở mô LCU cao hơn mô U. Sự khác biệt đều có ý nghĩa thống kê ở
cả 4 gen. Cụ thể, mức độ biểu hiện gen GHR và IL6ST ở mô LCU (6,64 và 11,44) cao hơn ở mô U (1,71 và 7,33) với p < 0,001. Biểu hiện mRNA gen INSR và
IFNAR1 ở mô LCU (4,54 và 3,82) cao hơn ở mô U (4,07 và 3,1) với giá trị p lần
lượt là 0,026 và 0,003.
INSR- insulin receptor là gen mã hóa thụ thể protein insulin của người.
Insulin là một trong những phối tử của con đường truyền tín hiệu nội bào JAK/STAT và được điều hòa bởi SOCS6 và SOCS7. hiều tế bào ung thư cần tín hiệu insulin để tăng trưởng và insulin truyền tín hiệu qua chính thụ thể của nó là INSR . Mức độ biểu hiện của INSR được biết đến với vai trị là tín hiệu kích hoạt tế bào của con đường tín hiệu insulin/IGF, chuột loại bỏ gen INRS đặc hiệu gan biểu hiện sự ức chế HCC . Ở những bệnh nhân HCC do HCV, tăng mức độ biểu hiện của INSR-4 góp phần vào hoạt động chống HCV qua tín hiệu IFN-a. IRS4 đã thúc đẩy tín hiệu JAK/STAT từ IFN-α bằng cách tương tác với USP18. Những kết quả này cho thấy INRS4 liên kết với USP18 để làm giảm tác động của USP18 đối với tín hiệu JAK/STAT do IFN-α gây ra. INRS4 là một protein liên kết USP18 có thể làm tăng khả năng miễn dịch bẩm sinh của vật chủ để kiểm soát HCV và các
loại virus khác nhạy cảm với IFN-α . Kết quả định lượng biểu hiện gen INSR của
chúng tơi cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa mơ LCU và mô U. Biểu hiện INSR tăng cao trong mơ LCU so với mơ U (Hình 3.3).
Hormone tăng trưởng GH có vai trị quan trọng trong q trình điều hịa các chất trong quá trình sinh trưởng của sinh vật thông qua thụ thể GHR. GH là tín hiệu của nhiều con đường truyền tín hiệu nội bào trong đó có con đường tín hiệu GHR/JAK2/STAT . Nghiên cứu về biểu hiện GHR ở mô cho thấy GHR biểu hiện tăng trong mô U ở những bệnh nhân ung thư vú so với mô LCU . Nghiên cứu của chúng tôi trên mô HCC đưa ra kết quả biểu hiện mRNA gen GHR cao hơn trong
mơ LCU có ý nghĩa thống kê so với mơ U (Hình 3.3).
Interferon (IFN)-α/β là các cytokine liên quan đến cả đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và thích ứng, đóng vai trị nịng cốt trong phịng chống ung thư, điều hòa biểu hiện mRNA của hơn 2000 gen thơng qua kích hoạt thụ thể IFNAR. Các thụ thể IFNAR bao gồm hai tiểu đơn vị IFNAR-1 và IFNAR-2 có liên quan đến biểu hiện lâm sàng của những bệnh nhân nhiễm HBV . Mức độ biểu hiện mRNA của
IFNAR-1 giảm ở mô u của những bệnh nhân ung thư đại trực tràng . Nghiên cứu
về biểu hiện mRNA của gen IFNAR-1 chúng tơi nhận thấy trong mơ LCU có biểu hiện mạnh hơn so với mơ U (Hình 3.3).
IL6ST là gen mã hóa của nhiều cytokine bao gồm interleukin 6 (IL6). Liên
kết IL6 với IL6R tạo ra sự đồng hóa IL6ST và hình thành phức hợp thụ thể có ái lực cao để kích hoạt các protein JAK, điều đó gây ra sự phosphoryl hóa tyrosine IL6ST, từ đó kích hoạt STAT . Nghiên cứu về mức biểu hiện mRNA của gen
IL6ST ở bệnh nhân ung thư vú nhận thấy mức độ biểu hiện mRNA IL6 được phát
hiện ở những mô ung thư vú, và tương quan với mức độ biểu hiện bệnh của bệnh nhân ung thư vú . Kết quả biểu hiện mRNA của gen IL6ST cao hơn ở mơ LCU so
Hình 3.16: Mức độ biểu hiện mRNA các gen IL10, IL10RA, LEP, LEPR, PRLR ở mô LCU và mô U
Kết quả trên Hình 3.4 cho thấy mức độ biểu hiện mRNA các gen IL10, IL10RA, LEP, LEPR ở mô LCU cao hơn mô U với giá trị p lần lượt là < 0,001,
<0,001, = 0,03 và < 0,001. Ngược lại, gen PRLR có biểu hiện mRNA ở mơ LCU thấp hơn biểu hiện mRNA ở mô U với p < 0,001.
Interleukin (IL)-10, một cytokine chống viêm Th2, là một trong những yếu tố chính của các phản ứng viêm, là phối tử của con đường truyền tín hiệu JAK/STAT. Nghiên cứu về mức độ biểu hiện của IL10 cho thấy, trong mơ hình hồi
quy logistic, biểu hiện mRNA IL10 từ trung bình đến cao của các tế bào khối u có liên quan đáng kể với khối u ác tính ở giai đoạn tăng trưởng. IL10 mRNA được phát hiện trong các đại thực bào và tế bào lympho liên quan đến khối u ác tính. Trong khối u ác tính xâm lấn, IL10 mRNA giảm khi mức độ di căn khối u ác tính
tăng lên. Biểu hiện IL10 cao hơn tương quan với sự tiến triển của khối u, với sự khác biệt giữa khối u ác tính tại chỗ, khối u ác tính xâm lấn và khối u ác tính di