a. Kết quả kiểm tra bằng phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)
Trong quá trình biến nạp, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp sàng lọc xanh trắng nhờ sự có mặt của operon Lacz có trong vector pBT. Theo phƣơng pháp sàng lọc này, các khuẩn lạc mang plasmid đã đƣợc chèn đoạn ADN ngoại lai sẽ có màu
1000 bp 1500 bp 1500 bp
trắng, ngƣợc lại các khuẩn lạc mang plasmid nhƣng không đƣợc chèn đoạn ADN ngoại lai sẽ có màu xanh. Để kiểm tra kích thƣớc đoạn chèn trong plasmid của các khuẩn lạc màu trắng trƣớc tiên chúng tôi sử dụng phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR). Tiến hành phản ứng colony-PCR với 7 khuẩn lạc trắng trong trƣờng hợp gen ltb-gp5m và 15 khuẩn lạc trắng trong trƣờng hợp gen ltb-gp3 sau đó điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ trên Hình 3.3.
Hình 3.3: Ảnh điện di sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc trên gel agarose 1%. A:
trƣờng hợp gen ltb-gp5m; B: trƣờng hợp gen ltb-gp3. (-): đối chứng âm; 1-7 và 1-15: Kí
hiệu các khuẩn lạc; M: Thang chuẩn ADN 1kb (Thermo Scientific).
Trong phản ứng PCR chúng tôi sử dụng cặp mồi M13 F/M13 R, là cặp mồi nằm trên vector pBT. Do vậy, kích thƣớc sản phẩm PCR sẽ bằng kích thƣớc của đoạn gen cộng thêm khoảng 120 bp đƣợc khuếch đại thêm từ trình tự của vector. Ảnh điện di sản phẩm PCR cho thấy trong trƣờng hợp gen ltb-gp5m chúng tôi đã
- 1 2 3 4 5 6 7 M - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 1500 bp A B 1000 bp
thu đƣợc 5 dòng 2, 3, 4, 5, 7 lên băng với kích thƣớc khoảng 1600 bp trong tổng số 7 dòng đã đƣợc PCR. Tƣơng tự, trong trƣờng hợp gen ltb-gp3 chúng tơi đã thu đƣợc 11 dịng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 14, 15 lên băng với kích thƣớc khoảng 1200 bp trong tổng số 15 dịng đƣợc PCR. Kích thƣớc này hồn tồn phù hợp với kích thƣớc tính tốn theo lý thuyết. Từ kết quả này, chúng tôi chọn ra các khuẩn lạc số 2, 3, 4, 5, 7 với mẫu ltb-gp5m và các khuẩn lạc số 2, 4, 6, 8 với mẫu ltb-gp3 để nuôi lỏng qua đêm rồi tách plasmid phục vụ cho phản ứng cắt kiểm tra plasmid với enzyme giới hạn BamHI.
b. Kết quả kiểm tra bằng phương pháp cắt plasmid với enzyme giới hạn BamHI
Dịch khuẩn nuôi lỏng qua đêm đƣợc tách plasmid theo quy trình đã trình bày ở mục 2.2.2.5. Plasmid sau khi tách đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8% cho kết quả nhƣ sau:
Hình 3.4: Ảnh điện di kiểm tra kết quả tách plasmid trên gel agarose 0.8%. 2-3-4-
5-7: plasmid tách từ các khuẩn lạc tƣơng ứng của mẫu ltb-gp5m; 2-4-6-8: plasmid tách từ các khuẩn lạc tƣơng ứng của mẫu ltb-gp3; M: Thang chuẩn ADN 1kb (Thermo Scientific).
Kết quả điện di cho thấy plasmid tách ra đạt chất lƣợng tốt, có thể sử dụng cho phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn tiếp theo.
Vector tách dòng pBT đƣợc thiết kế có hai vị trí nhận biết của enzyme
BamHI ở hai đầu vị trí đa điểm (multicloning site), do vậy khi cắt plasmid với
enzyme này chúng tơi có thể kiểm tra kích thƣớc đoạn ADN đã đƣợc chèn vào. Kết quả cắt đƣợc minh họa trên Hình 3.5.
Hình 3.5: Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid với enzyme giới hạn BamHI trên gel
agarose 1%. 2-3-4-5-7: sản phẩm cắt các plasmid tách từ các khuẩn lạc tƣơng ứng của mẫu
ltb-gp5m; 2-4-6-8: sản phẩm cắt các plasmid tách từ các khuẩn lạc tƣơng ứng của mẫu ltb- gp3; M: Thang chuẩn ADN 1kb (Thermo Scientific).
Theo tính tốn lý thuyết, nếu vector pBT mang đoạn ADN ngoại lai là đoạn gen ltb-gp5m thì khi cắt với enzyme BamHI sẽ văng ra băng khoảng 1600 bp.
Tƣơng tự, nếu vector pBT mang đoạn ADN ngoại lai là đoạn gen ltb-gp3 thì khi cắt với enzyme BamHI sẽ văng ra băng khoảng 1200 bp. Ảnh điện di kiểm tra sản
phẩm cắt trên Hình 3.5 cho thấy ở tất cả các trƣờng hợp sản phẩm cắt đều văng ra băng ADN có kích thƣớc đúng nhƣ tính tốn. Chứng tỏ các dòng này đều mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen mong muốn.