12 3 M 34 M1 234 M
3.2.3. Kết quả phản ứng LR
1500 bp
1000 bp 1000 bp 1000 bp
Các vector pDONR 201-ltb-gp5m, pDONR 201-ltb-gp5, pDONR 201-ltb-
gp3 đƣợc lai với vector nhận pCB-GW-35S bằng phản ứng LR nhằm tạo ra các
vector chuyển gen pCB-GW-35S-ltb-gp5m, pCB-GW-35S-ltb-gp5, pCB-GW-35S-
ltb-gp3. Phản ứng LR đã đƣợc tiến hành với thành phần và điều kiện nhƣ đã trình
bày trong Bảng 2.11. Tƣơng tự nhƣ phản ứng BP, sản phẩm của phản ứng LR đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH 5α. Sau đó ở mỗi mẫu chúng tơi chọn ngẫu nhiên một số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch nuôi lỏng qua đêm để tách thu lấy plasmid rồi tiến hành phản ứng PCR dựa trên khuôn là các plasmid này. Phản ứng PCR sử dụng mồi xuôi là mồi P35S-for đƣợc thiết kế từ trình tự promotor 35S trong vector pCB-GW-35S còn mồi ngƣợc là mồi cmyc-rev đặc hiệu cho gen. Do đó, dƣới sự kết hợp của hai mồi này các băng thu đƣợc trong sản phẩm PCR với kích thƣớc phù hợp cho mỗi gen sẽ phản ánh chính xác kết quả phản ứng lai LR. Hình 3.12 là kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%.
1 2 3 4 M 1 2 3 4 M - 1 2 3 4 M
A B C
Hình 3.12: Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra kết quả của phản ứng LR trên gel
agarose 1%. A: trƣờng hợp gen ltb-gp5m; B: trƣờng hợp gen ltb-gp5; C: trƣờng hợp gen ltb-gp3; 1-4: Kí hiệu các khuẩn lạc; M (A,C): Thang chuẩn ADN 1kb (Thermo Scientific);
M (B): Thang chuẩn ADN 1kb (Geneshun).
Ở trƣờng hợp gen ltb-gp5m sản phẩm PCR của cả 4 dịng đều lên băng với
kích thƣớc khoảng 1500 bp, ở trƣờng hợp gen ltb-gp5 sản phẩm PCR của cả 4 dịng đều lên băng với kích thƣớc khoảng 1000 bp và ở trƣờng hợp gen ltb-gp3 có 3 trong tổng số 4 dịng sản phẩm PCR lên băng với kích thƣớc khoảng 1100 bp. Các kích thƣớc này đều trùng với kích thƣớc theo tính tốn lý thuyết của từng đoạn gen khi sử dụng cặp mồi P35S-for/cymyc-rev. Nhƣ vậy, bằng kỹ thuật Gateway, chúng tôi
1000 bp 1500 bp 1500 bp
đã thiết kế thành công các vector chuyển gen pCB-GW-35S-ltb-gp5m, pCB-GW- 35S-ltb-gp5, pCB-GW-35S-ltb-gp3. Sẵn sàng cho việc chuyển các gen này vào tế