Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 2 phút
30
2 Biến tính 94 30 giây
3 Gắn mồi 54 50 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 10 phút
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.2.3. Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose Quy trình.
- Cắt vùng gel chứa đoạn DNA quan tâm trên bản điện di.
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nƣớc khử ion vơ trùng 12,8
Buffer (10X) 2,5
MgCl2 (25 mM) 2,5
dNTPs (10 mM) 2,5
Primer barcode_F (100 pmol/µl) 1
Primer barcode_R (100 pmol/µl) 1
Taq DNA polymerase (6 unit/µl) 0,7
DNA 2
- Cân đoạn gel vừa cắt đƣợc và xác định thể tích đoạn gel này theo quy ƣớc 1mg trọng lƣợng sẽ tƣơng đƣơng với 1 µl thể tích.
- Bổ sung dịch kết gắn DNA vào cột tinh sạch GB (Gel Binding), theo tỉ lệ: Vmẫu:VGB = 1:1.
- Ủ hỗn hợp ở 60oC trong 10 phút và cứ 2 phút thì đảo nhẹ 1 lần cho đến khi gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết DNA và ly tâm 13000 vòng/phút (v/p) trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Tiếp tục bổ sung đệm rửa 0,7 ml WB (Washing Buffer), ly tâm 13.000v/p. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm thêm 1 lần nữa trong vòng 1 phút để loại đệm WB.
- Chuyển cột sang ống Eppendorf mới 1,5 ml. Bổ sung 30 µl nƣớc khử ion khử trùng, để ở nhiệt độ phòng 1 phút và ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút để thu mẫu DNA.
2.2.2.4. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector
Sau khi đoạn DNA đƣợc tinh sạch, tiến hành gắn chúng vào vector tái tổ hợp thông qua phản ứng lai DNA sử dụng enzyme DNA T4 - ligase. Vector sử dụng là vector pBT (Hình 2.1)
Hình 2.1. Sơ đồ vector pBT
Phản ứng ghép nối ở điều kiện 22oC trong 1h30’.Sản phẩm sau khi ghép nối đƣợc sử dụng để biến nạp.