Thành phần phản ứng Tổng thể tích (µl)
H2O 5
Buffer fof BamHI 1
BamHI 1
Plasmid 3
Hỗn hợp phản ứng đƣợc mang ủ ở 37o C. Sau đó mang điện di kiểm tra các plasmid đạt yêu cầu sẽ đƣợc giữ lại để mang đọc trình tự.
2.2.2.9. Phương pháp xử lý trình tự
Phân đoạn DNA chỉ thị sau khi tách dịng thành cơng trong vector pBT đƣợc gửi đi phân tích trình tự tại công ty Macrogen (Công ty tham gia vào dự án giải trình tự bộ gen ngƣời). Về nguyên tắc, trình tự đƣợc xác định theo nguyên tắc đọc trình tự của Sanger. Sau đó sẽ so sánh trình tự DNA này với ngân hàng gen tại Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học (NCBI) của Hoa Kỳ.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng số 3.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng số
Để tách chiết DNA đa ̣t hiệu suất và độ tinh sa ̣ch nhất thì việc lƣ̣a cho ̣n một phƣơng pháp tách chiết phù hợp với đối tƣợng nghiên cứu là rất quan tr ọng. Hiện nay, phƣơng pháp tách chiết DNA sử dụng CTAB là phƣơng pháp khá phổ biến để tách chiết DNA từ các mẫu có nguồn gốc thực vật. Phƣơng pháp sử dụng lần đầu tiên đƣợc Murray and Thompson mô tả vào năm 1980, tới nay đã đƣợc sử dụng rất phổ biến có hiệu quả với các mẫu khó tách chiết nhƣ thực vật giàu polysaccharides hay các sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật.
Trong nghiên cứu này, các mẫu lá và gỗ các cây dó bầu đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp CTAB các bƣớc tiến hành nhƣ mục 2.2.1 chƣơng 2. Quá trình này gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: các mẫu lá dó bầu đƣợc nghiền nhanh trong nitơ lỏng thành bột mịn bằng cối chày sứ để phá vỡ tế bào.
- Giai đoạn 2: Làm biến tính protein, loại bỏ protein và các thành phần hữu cơ khác bằng phenol: chloroform:isoamylalcohol (25 : 24 : 1).
T1 T2 T3 T4 T6 T7 T8 T9 T10 T11
- Giai đoạn 3: Tủa DNA bằng isopropanol hay ethanol 100%, thƣờng tủa bằng isopropanol lạnh trƣớc, sau đó tiếp tục rửa cặn DNA bằng ethanol. Sau đó để loại bỏ RNA chúng tơi bổ sung thêm 0,5µl RNase (100mg/ml) ủ ở 37oC trong 2 giờ. Chất lƣợng DNA thu đƣợc sau tách chiết và tinh sạch ảnh hƣởng rất lớn đến kết quả quá trình nghiên cứu. Một số vấn đề thƣờng hay gặp là DNA thu đƣợc sau khi tách chiết bị phân huỷ và đứt gãy. Do vậy sau khi tách chiết DNA, chúng tôi kiểm tra chất lƣợng DNA thu đƣợc bằng phƣơng pháp điện di. Kết quả sau khi điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm bằng Ethidium bromide (hình 3.1) cho thấy DNA thu đƣợc sau khi tách có chất lƣợng tốt, DNA không bị đứt gẫy, các băng vạch đều sáng rõ.
3.2. Tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu của phản ứng PCR
Khuếch đại đoạn gen là công đoạn đầu tiên nhằm nhân lên các đoạn DNA chỉ thị mong muốn sử dụng các cặp mồi đặc hiệu. Trong nhiều công bố gần đây về sử dụng DNA barcode (Yonghua Li và cộng sự, 2010), các tác giả cho thấy việc nhân bản thành cơng các trình tự DNA barcode bằng phản ứng PCR phụ thuộc rất nhiều vào chất lƣợng DNA dùng làm khuôn và đặc biệt là nhiệt độ bắt mồi đặc hiệu (Yonghua Li và cộng sự, 2010).