- Giai đoạn 3: Tủa DNA bằng isopropanol hay ethanol 100%, thƣờng tủa bằng isopropanol lạnh trƣớc, sau đó tiếp tục rửa cặn DNA bằng ethanol. Sau đó để loại bỏ RNA chúng tơi bổ sung thêm 0,5µl RNase (100mg/ml) ủ ở 37oC trong 2 giờ. Chất lƣợng DNA thu đƣợc sau tách chiết và tinh sạch ảnh hƣởng rất lớn đến kết quả quá trình nghiên cứu. Một số vấn đề thƣờng hay gặp là DNA thu đƣợc sau khi tách chiết bị phân huỷ và đứt gãy. Do vậy sau khi tách chiết DNA, chúng tôi kiểm tra chất lƣợng DNA thu đƣợc bằng phƣơng pháp điện di. Kết quả sau khi điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm bằng Ethidium bromide (hình 3.1) cho thấy DNA thu đƣợc sau khi tách có chất lƣợng tốt, DNA không bị đứt gẫy, các băng vạch đều sáng rõ.
3.2. Tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu của phản ứng PCR
Khuếch đại đoạn gen là công đoạn đầu tiên nhằm nhân lên các đoạn DNA chỉ thị mong muốn sử dụng các cặp mồi đặc hiệu. Trong nhiều công bố gần đây về sử dụng DNA barcode (Yonghua Li và cộng sự, 2010), các tác giả cho thấy việc nhân bản thành cơng các trình tự DNA barcode bằng phản ứng PCR phụ thuộc rất nhiều vào chất lƣợng DNA dùng làm khuôn và đặc biệt là nhiệt độ bắt mồi đặc hiệu (Yonghua Li và cộng sự, 2010).
Bảng 3.1 Nhiệt độ bắt mồi và kích thƣớc gen của các cặp mồi nghiên cứu STT Vùng gen STT Vùng gen
nhân bản
Ký hiệu mồi
Kích thƣớc đoạn gen nhân
bản Nhiệt độ bắt cặp mồi lý thuyết Nhiết độ bắt cặp mồi thực tế 1 rbcL P2F 750 bp 53 54 P2R 60 2 rpoB P5F 500 bp 59 54 P5R 60 3 psbA-trnH P10F 450 bp 57 56 P10R 72 4 ITS P12F 800 bp 74 57 P12R 76
Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành các thí nghiệm xác định nhiệt độ bắt mồi tối ƣu nhằm nhân bản đặc hiệu các trình tự barcode của 4 cặp mồi. Bốn cặp mồi chúng tôi tiến hành nghiên cứu đƣợc thiết kế dựa theo Vijayan và Tsou (2010). Chúng tôi tiến hành thử nghiệm nhiệt độ gắn mồi của 4 cặp mồi và kiểm tra kích thƣớc nhân bản thực tế của 4 gen này với 18 mẫu dó bầu. Sau q trình thử nghiệm với các dải nhiệt độ gắn mồi khác nhau, đã xác định đƣợc nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu cho 4 cặp mồi nghiên cứu và kích thức nhân bản của 4 gen này so với dự đoán ban đầu có sự thay đổi thể hiện trên bảng 3.1
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy ở các ngƣỡng nhiệt độ thấp không thu đƣợc sản phẩm PCR hoặc sản phẩm PCR khơng có chất lƣợng tốt. Trong khi ở nhiệt độ đặc hiệu, ở tất cả các mồi đều thu đƣợc một vạch DNA duy nhất và rõ nét. Ở ngƣỡng nhiệt độ cao không thu đƣợc sản phẩm PCR (hình 3.2). Nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu của 4 cặp mồi dao động từ 54 - 570
C.
Hình 3.2. Kết quả chạy PCR - gradient của chỉ thị rpoB ở các ngƣỡng nhiệt độ từ 49o
C tới 58oC
Trên hình 3.2 cho thấy ở các ngƣỡng nhiệt độ khác nhau cho các kết quả khác nhau ở nhiệt độ 49oC, 50oC, 51oC, 52oC không xuất hiện băng vạch, nhiệt độ 53oC, 54oC, 55oC, 56oC, 57oC cho một băng vạch duy nhất tuy nhiên chỉ ở 54oC mới cho đƣợc băng vạch rõ nét còn các nhiệt độ còn lại băng vạch xuất hiện mờ khơng rõ nét, ngồi ra nhiệt độ cao hơn 57oC không thấy xuất hiện băng vạch. Do
vậy, chúng tôi xác định nhiệt độ thích hợp sử dụng trong chỉ thị này là 54oC. Và chúng tôi xác định đƣợc sản phẩm PCR sử dụng mồi rpoB có kích thƣớc khoảng
500 bp. Sản phẩm PCR thu đƣợc đƣợc tinh sạch để đọc trình tự.
Sau khi tối ƣu hóa nhiệt độ gắn mồi và các yếu tố khác chúng tôi tiến hành nhân bản bằng phản ứng PCR kết quả thu đƣợc với từng gen nhƣ sau:
3.3. Kết quả nhân bản gen với các cặp mồi nghiên cứu
3.3.1. Kết quả nhân bản gen rbcL
rbcL là trình tự gen nằm trong lục lạp có thể nhân bản một cách dễ dàng ở
nhiều lồi thực vật. Ở các lồi khác nhau kích thƣớc của gen này cũng khác nhau, đối với cây dó bầu gen rbcL có kích thƣớc khoảng 750 bp.
Kết quả kiểm tra sản phẩm điện di gen rbcL trên gel agarose 0,8% (hình 3.3) cho thấy gen rbcL đƣợc khuếch đại tốt ở tất cả các mẫu dó bầu nghiên cứu, các
băng thu đƣợc đều sáng và rõ chỉ có một băng vạch duy nhất với kích thƣớc khoảng 750 bp (khi so sánh với thang DNA chuẩn 1kb). Đây kết quả tốt tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen rbcLcủa các mẫu dó bầu nghiên cứu M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4,
T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
3.3.2. Kết quả nhân bản gen rpoB
rpoB là một trong những gen cơ bản trong việc nghiên cứu sự phát sinh loài,
đã đƣợc sử dụng ở nhiều nhóm sinh vật khác nhau.
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen rpoB của các mẫu dó bầu nghiên cứu M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4,
T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
Kết quả trên bản điện di cho thấy các băng đều sáng rõ và chỉ có một băng vạch duy nhất với kích thƣớc khoảng 500 bp đúng nhƣ kích thƣớc dự đốn ban đầu ở tất cả các mẫu nghiên cứu (hình 3.4).
3.3.3 Kế quả nhân bản gen psbA-trnH
Gen trnH-psbA có kích thƣớc trung bình khoảng 450 bp, nhƣng thay đổi từ
296 đến 1120 bp. trnH-psbA có khả năng xác định loài cao. Locus trnH-psbA đã
khuếch đại thành công ở nhiều thực vật hạt kín và hạt trần, dƣơng xỉ, rêu. Với các mẫu dó bầu nghiên cứu gen psbA-trnH có kích thƣớc vào khoảng 450 bp (hình 3.5)
Hình 3.5.Kết quả điện di sản phẩm PCR gen psbA-trnH của các mẫu dó bầu nghiên cứu M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4,
T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
500 bp
3.3.4. Kết quả nhân bản gen ITS
ITS là gen nhân đƣợc sử dụng nhiều trong phân tích đa dạng và xác định lồi
ở thực vật, tuy nhiên việc nhân bản gen này thƣờng gặp khó khăn trong việc khuếch đại PCR đơn gen hoặc số lƣợng bản sao của gen ít. Kết quả nhân bản gen ITS ở cây dó bầu cho thấy gen ITS có kích thƣớc khỏang 800bp. Kết quả điện di sản phẩm
PCR trên gel agarose 0,8% cho thấy các băng vạch đều sáng rõ nét và chỉ có một băng duy nhất điều này chứng tỏ q trình nhân bản gen ITS có kết quả tốt ở cả 18 mẫu dó bầu nghiên cứu (hình 3.6).
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen ITS của các mẫu dó bầu nghiên cứu M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4,
T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
3.4. Kết quả tách dòng gen
3.4.1 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel)
Sản phẩm PCR thu đƣợc sau phản ứng khuếch đại gen có các tạp chất nhƣ mồi, đệm PCR, các nucleotide,...cịn dƣ, và đơi khi có thể chứa các sản phẩm phụ sẽ ảnh hƣởng đến kết quả của q trình tách dịng, do vậy cần tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trƣớc khi tiến hành q trình đƣa gen vào vector tách dịng. Việc tinh sạch đƣợc thực hiện bằng bộ Kit AccuPrep Gel Purification Kit. Nguyên lý của phản ứng và quy trình thực hiện đƣợc nêu ở mục 2.2.2.3. Các đoạn gen sau khi tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8% để kiểm tra chất lƣợng và xác định sơ bộ hàm lƣợng DNA tinh sạch, kết quả thể hiện ở hình 3.7