2.1.2. Động vật thử nghiệm
Chuột nhắt trắng
Chuột nhắt trắng Swiss, 4-6 tuần tuổi, với trọng lượng trung bình 20-22g được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương được sử dụng để nghiên cứu độc tính cấp của dịch chiết dành dành.
Phôi cá ngựa vằn
Cá ngựa vằn được ni tại phịng thí nghiệm thuộc Bộ mơn Sinh học Tế bào, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội ở điều kiện nhiệt độ 27 ± 1°C, chu kỳ sáng 14/10 (14 giờ sáng, 10 giờ tối) trong nước đã lọc qua màng lọc nano (Geyser). Cá được cho ăn 2 lần mỗi ngày bằng thức ăn khơ (ZM300) hoặc thức ăn tươi (lịng đỏ trứng, artemia) vào sáng và chiều.
Phơi thí nghiệm được thu từ cá bố mẹ vào đầu chu kỳ sáng ở giai đoạn từ 4 - 64 tế bào, được rửa sạch chất bẩn bám trên vỏ và loại bỏ những phôi chết hoặc phát triển bất thường.
2.2. Hóa chất và thiết bị
Hóa chất
Nước cất
Nước cất loại ion
Ethanol (Trung Quốc, Merck) Methanol (Trung Quốc, Merck) NaOH (Trung Quốc)
HCl (Trung Quốc) Axit ascorbic (Merck)
1,1- diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Merck)
Methanol HPLC (J.T. Baker 9093- Avantor Performance Materials, USA) Thiết bị
Bình định mức 1000 ml, 100ml, 50ml, 25ml, 10ml.
Pipet: 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, pipet thủy tinh, pipet pasteur Bình tam giác 250ml, cốc thủy tinh 100 ml, 250 ml.
Ống nhỏ giọt, ống nghiệm thủy tinh, ống eppendorf, ống falcon Bình tia, phễu lọc, cối sứ, chày sứ, giấy lọc thường.
Đèn UV, đĩa 24 giếng, tủ lạnh, máy ly tâm, cân, kính hiể n vi Hệ thống HPLC (Shimadzu)
Hệ thống LC-MS (Agilent)
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography- HPLC) là một trong những kỹ thuật sắc ký sử dụng để phân tách một hỗn hợp chất với mục đích xác định, định lượng và phân lập từng thành phân riêng lẻ của hợp
chất. Để xác định hàm lượng crocin trong dịch chiết dành dành, mẫu chuẩn và mẫu thử nghiệm (dịch chiết) được phân tích HPLC trong điều kiện giống nhau.
Chuẩn bị mẫu
Mẫu chuẩn crocin (Sigma) được chuẩn bị ở nồng độ 0,5 mg/mL. Dịch chiết dành dành được chuẩn bị ở nồng độ 2,0 mg/mL.
Điều kiện chạy HPLC
Loại thiết bị: Shimazu
Loại cột Cột: Atlantis C18, 5 µm, hãng Water Chiều dài cột 4,6 x 250 mm.
Thời gian phân tích : 45 phút Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút Bước sóng phân tích: 440 nm Thể tích mẫu bơm:
+ Mẫu chuẩn: 10 μl, 15 μl, 20 μl, 25 μl, 30 μl. + Dịch chiết: 10 μl.
Pha động sử dụng hệ hai dung môi: H2O (kênh A) – MeOH (kênh B)
Thời gian (phút) Dung môi (MeOH:nước)
0,20 20:80 2,00 20:80 5,00 25:75 10,00 40:60 20,00 60:40 24,00 100:0 35,00 100:0 45,00 20:80 2.3.2. Sắc kí lỏng kết hợp khối phổ (LC-MS)
Sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (LC-MS) là một kỹ thuật phân tích hiệu quả dựa trên khả năng phân tách các thành phần của hợp chất bằng sắc ký lỏng kết hợp
với độ đặc hiệu phát hiện của khối phổ. Sắc ký lỏng (LC) tách các thành phần mẫu và sau đó đưa chúng vào máy đo khối phổ (MS). Dữ liệu LC-MS có thể được sử dụng để cung cấp thông tin về khối lượng phân tử, cấu trúc, đặc điểm và hàm lượng của các thành phần mẫu cụ thể.
Chuẩn bị mẫu
Mẫu chuẩn crocin (Sigma) được chuẩn bị ở nồng độ 0,5mg/mL. Dịch chiết dành dành được chuẩn bị ở nồng độ 2mg/mL.
Điều kiện chạy LC-MS
Máy LC-MS: Agilent
Cột sắc ký: Cột VertiSep GES C18 (150 x 4.6 mm, 5μm) và cột bảo vệ GES C18 của hãng Vertical.
Màng lọc 0,45 µm cho kim bơm mẫu dùng để lọc mẫu trước khi bơm vào hệ thống LC-MS.
Pha động sử dụng hệ hai dung môi: H2O (kênh A) – MeOH (kênh B) biến đổi gradient từ tỉ lệ A:B từ 60:40 đến 0:100
Lượng mẫu bơm: 5 µl. Tốc độ dịng: 0,5 ml/phút. Thời gian phân tích: 25 phút Bước sóng phân tích: 440nm.
Hệ thống LC-MS được kết nối với phần mềm Agilent OpenLAB Control Panel. Khí nitơ được bơm với tốc độ dòng 5,0 L/phút, áp suất đầu phun đạt 40 psi, nhiệt độ làm khô đạt 250ºC.
Phương pháp này được thực hiện tại Trung tâm tiên tiến về hóa sinh hữu cơ thuộc Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam
2.3.3. Khảo sát tác dụng chống oxi hoá của dịch chiết dành dành
Về nguyên tắc, các chất chống oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydro, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng nhạt dần, chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt. Phương pháp nghiên cứu này được thực hiện dựa trên mô tả của W.Brand-Williams và cộng sự [3] bằng cách
chuẩn bị dung dịch DPPH 0,2M trong ethanol (Merck) sau đó bổ sung 1,0 mL dung dịch này vào 1,0 mL dịch chiết dành dành trong nước cất ở nồng độ 0,005-1 g/L. Hỗn hợp được giữ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm. Sự giảm độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của mẫu. Các phép đo được thực hiện ba lần. Axit ascorbic được sử dụng làm chất chuẩn. Tỷ lệ ức chế (phần trăm) được tính theo phương trình sau:
Ức chế (%) = [1- (Ai - Aj) / A0] × 100
Trong đó, A0 là độ hấp thụ của mẫu trắng (DPPH), Ai là độ hấp thụ của mẫu có chứa DPPH và có nồng độ màu khác nhau. Aj là độ hấp thụ của mẫu đối chứng (dịch chiết). Giá trị IC50 được tính tốn bằng đồ thị.
2.3.4. Khảo sát tính an tồn của chế phẩm màu 2.3.4.1. Đánh giá độc tính trên chuột 2.3.4.1. Đánh giá độc tính trên chuột
18 con chuột nhắt trắng Swiss được chia làm 3 lơ, 6 con/lơ, trong đó có 1 lơ đối chứng và 2 lơ thử nghiệm. Các con chuột được bỏ đói 16 giờ trước khi cho uống 1 liều duy nhất dịch chiết dành dành. Mức liều của dịch chiết dành dành được sử dụng cho chuột là 2,062 mg/kg, 4,125 mg/kg, 8,250 mg/kg, 16,500 mg/kg và 33,000 mg/kg trọng lượng cơ thể (dịch chiết dành dành được pha trong nước cất vô trùng).
Sau khi cho chuột uống dịch chiết dành dành từ 1 đến 2 giờ, cho chuột ăn uống như bình thường và tiếp tục theo dõi trong 72 giờ để xác định số chuột chết trong mỗi lơ thử nghiệm, từ đó tính tốn giá trị LD50.
2.3.4.2. Đánh giá ảnh hưởng lên phát triển của phôi cá ngựa vằn
Dịch chiết của dành dành được pha với nước từ bột màu dành dành theo dải nồng độ: 0,1 g/L, 0,5g/L, 1g/L, 2g/L, 4g/L, 8g/L, 12 g/L để thử nghiệm độc tính với phơi cá ngựa vằn.
Quy trình thử độc trên phơi cá ngựa vằn dựa theo hướng dẫn của OECD về thử độc trên đối tượng phôi cá (OECD 236). Phôi cá ngựa vằn sau khi chọn lọc sẽ được chuyển vào đĩa 24 giếng có chứa hóa chất với mật độ 1 phơi/giếng. Mỗi giếng
thử nghiệm sẽ được thay mới hóa chất, quan sát, ghi lại tỷ lệ sống chết và các hình thái phơi phát triển bất thường sau mỗi 24 giờ cho tới thời điểm 72 giờ. Thử nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần.
2.3.5. Khảo sát một số tính chất vật lý của chế phẩm 2.3.5.1. Độ hòa tan 2.3.5.1. Độ hòa tan
Bột dành dành khơ được hịa tan với nước ở các nồng độ 0,1 g/L, 0,4 g/L và 0,8 g/L để tạo thành dung dịch đồng nhất. Quan sát mức độ đồng nhất của dung dịch trong điều kiện ánh sáng thường.
2.3.5.2. Khả năng chịu pH
Chuẩn bị dịch chiết dành dành trong nước với nồng độ 0,4 g/L. NaOH 0,5N và HCl 0,5N được sử dụng để thay đổi pH của dung dịch mẫu từ 1,0 đến 12,0. Sau đó, sự thay đổi màu sắc được quan sát và độ hấp thụ của tất cả các mẫu được ghi lại bằng máy quang phổ UV-Vis ở bước sóng 440nm.
2.3.5.3. Khả năng chịu nhiệt
Độ bền nhiệt của màu vàng được xác định ở các nhiệt độ khác nhau từ 40- 100°C. Ở mỗi nhiệt độ, mẫu được giữ trong nồi cách thủy trong 5 phút. Sự thay đổi màu sắc được quan sát và độ hấp thụ của tất cả các mẫu được ghi lại bằng máy đo quang phổ UV-Vis ở bước sóng 440 nm.
2.3.5.4. Độ bền màu trong thời gian bảo quản
Bột màu dành dành được bảo quản ở 4°C trong 12 tháng và độ hấp thụ được xác định tại tháng 0; 6 và 12 bằng máy đo quang phổ UV-Vis ở bước sóng 440 nm.
2.3.6. Xử lý số liệu
Phần mềm Graphpad Prism 6.0 được dùng để phân tích hồi quy và xây dựng biểu đồ đường cong đáp ứng liều trong thử nghiệm độc tính trên phơi cá ngựa vằn.
Phần mềm Excel 2010 được sử dụng để xác định đường tuyến tính và xử lý các số liệu, tính tốn các giá trị IC50, LD50.
Mối liên hệ giữa thể tích mẫu và hàm lượng được tính tốn dựa trên cơng thức sau đây:
𝐶 =𝑚 𝑉
Trong đó, C là nồng độ của mẫu (μg/ul), m là hàm lượng chất tan trong mẫu tính (μg) và V là thể tích của mẫu (μl).
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tích hàm lượng crocin trong dịch chiết từ quả dành dành 3.1. Phân tích hàm lượng crocin trong dịch chiết từ quả dành dành 3.1.1. Chuẩn bị dịch chiết
Hạt dành dành khô được chiết với nước theo các tỉ lệ từ 1:2,5 đến 1:20 (trọng lượng: thể tích) ở 100ºC trong 5 phút. Sau đó, dịch chiết được lọc qua lưới (kích thước mắt 20 - 40 µm) để loại bỏ cặn và sấy khơ để thu được dạng bột màu vàng. Khối lượng bột màu dành dành được ghi lại và so sánh với khối lượng hạt dành dành nguyên liệu. Kết quả được thể hiện ở hình 6 dưới đây.